Jeux de données

Le programme BlastP a été utilisé contre les protéines déduites des gènes identifiés sur les génomes complets avec comme séquences sondes les protéines ComE et ComD de S. pneumoniae. Nous avons utilisé une valeur seuil de e-value de 1e-05. Nous avons réalisé des alignements et des arbres afin d'éliminer les séquences partielles ou très divergentes des séquences ComE ou ComD. Les séquences retenues ont été extraites et sont collectées dans deux fichiers au format FASTA :  ComD et  ComE. Nous n'avons pas retenu de séquences dans les génomes de S. agalactiae et S. suis. Les informations associées à ces séquences sont compilées dans le tableau 1 (format Excel). Ce tableau est trié par groupes taxonomiques, par nom d'espèce et par position des gènes sur le chromosome. En l'absence de données expérimentales, nous prédisons que les partenaires d'un même système (HK et RR) sont codés par des gènes voisins sur le chromosome. Afin de faciliter l'étude de la coévolution des partenaires des systèmes, nous avons exclu  des  fichiers FASTA  les systèmes incomplets.
En plus du système, Com, les régulons Blp et Fas ont été étudiés expérimentalement.

• Blp est impliqué dans la production de bactériocines. Un petit peptide inducteur (BlP) est codé par le gène blpC. Il est probablement maturé et exporté par le  transporteur ABC BlpAB. En réponse au BlP, l'histidine kinase BlpH s'auto-phosphoryle et transmet son phosphate au régulateur de réponse BlpR.
• Fas (fibronectin/fibrinogen binding/haemolytic activity/streptokinase regulator) a été identifié chez Streptococcus pyogenes. Le système se compose d'un régulateur de réponse (FasA), de deux histidines kinases (FasB et FasC) et probablement d'un petit ARN non transcrit. Ce système ne serait pas impliqué dans la régulation par quorum sensing mais dans la régulation de l'expression de facteurs de virulences chez les Streptococcus pathogènes du groupe A (GAS).

Les séquences de Staphylococcus epidermidis et Staphylococcus aureus seront utilisées pour enraciner les arbres.

Analysez le tableau 1. Quelles observations pouvez-vous faire?

Alignement multiples des séquences homologues a ComE de S. pneumoniae

Si seaview n'est pas installé :

1. Aller sur http://doua.prabi.fr/software/seaview
2. Télécharger la version 64-bit_Linux_on_x86_64  (vous obtenez le fichier  seaview5-64.tgz)
3. faire gzip -d seaview5-64.tgz
4. faire tar -xvf seaview5-64.tar

Cette action va vous créer un répertoire seaview.
Faire:  pwd (cette commande va indiquer le chemin de votre répertoire seaview (ex :/home/guest/Fichant/seaview)

Vous mettre dans le répertoire où vous avez vos fichiers de séquences faire pour lancer le programme seaview :
/home/guest/Fichant/seaview/seaview& (en remplaçant /home/guest/Fichant/seaview par le résultat de votre "pwd")

Réaliser l'alignement multiple des séquences homologues à ComE avec le programme muscle au travers du logiciel seaview.

1. Ouvrir votre fichier séquences dans seaview (menu File).
2. Dans le menu Align aller dans Alignment options et cocher muscle
3. Sélectionner Align all, une nouvelle fenêtre s'ouvre avec la progression de l'alignement, cliquer sur OK pour accepter l'alignement dans l'éditeur.
4. Sauvegarder l'alignement en format Fasta (menu File Save as, dans type choisir Fasta). Attention au nom de fichier, pas d'espace, d'accentuation etc. Conseil : ComE_muscle.fst

Vérifier la qualité de l'alignement et effectuer des corrections manuellement si nécessaire. 

Construction des arbres en utilisant la méthode de distance BioNJ

Distance Poisson

Dans le menu Trees, sélectionner Distance Methods, choisir la méthode NJ et la distance Poisson. Vérifier que l'option ignore all gap sites est cochée. Pour avoir  une évaluation statistique de notre topologie d'arbre, effectuer une analyse Bootstrap avec 100 itérations.

L'arbre calculé s'affiche dans un éditeur d'arbre. Vous pouvez choisir entre plusieurs représentations et afficher ou non les longueurs de branches et les valeurs de bootstrap. 

• Re-root permet d'enraciner l'arbre à l'aide d'un sous-arbre ou d'une séquence (selectionner le noeud correspondant).
• Swap permet de faire tourner autour d'un noeud, les deux sous-arbres définis par ce noeud.

Pour les autres options se référer au menu Help.

Sauvegarder votre arbre avec le menu File, Save rooted tree. Pour le nom du fichier arbre utiliser l'extension .ph, exemple ComE_muscle_Poisson_tree.ph).Vous pouvez également utiliser l'option Save to Trees menu pour conserver l'arbre avec le fichier alignement (il apparaîtra dans le menu Trees).

Format Newick

Ouvrir le fichier arbre avec un éditeur de texte. Vous découvrirez comment les arbres sont codés en informatique, le format Newick qui est utlisé par la plupart des programmes de phylogénie et interprété pour vous fournir une visualisation graphique d'arbre. Les groupes de séquences sont séparés par des parenthèses, les différents groupes par des virgules, le point virgule indique la fin de l'arbre. Les longueurs de branches sont indiquées par des valeurs précédées de deux points et les valeurs de bootstrap sont indiquées juste après la parenthèse fermante délimitant les groupes.

Distance Kimura

Calculer l'arbre avec la distance Kimura toujours en utilsant la méthode NJ.
Enraciner l'arbre si nécessaire (Re-root)  
Editer les deux arbres obtenus avec les modèles de Poisson et Kimura (Swap) de façon à ce que l'ordre des feuilles sur les deux  topologies soient les plus proches possibles.
Comparez les deux topologies, en particulier les longueurs des branches, les valeurs de bootstraps et les incongruences?
Ne pas oublier quand vos deux toplogies sont correctes de sauvegarder vos deux arbres ( menu File, Save rooted tree)

Comparaison des bipartitions des arbres obtenues avec les distances de Poisson et Kimura

Nous allons rechercher les bipartitions communes à un ensemble d'arbre. Une bipartition est obtenue par la coupure d'une branche qui sépare les feuilles en deux sous-ensembles.

Nous allons utiliser rstudio. Pour utiliser l'environnement installé pour son utilisation en évolution moléculaire faire :

mamba activate evomol 
rstudio&

Ensuite dans le menu File, choisir New File et R Markdown.

Ceci va vous permettre de conserver vos script dans un fichier que vous pourrez recharger dans rstudio la fois prochaine. La fenêtre de rstudio va être divisée en quatre. En haut, à gauche le fichier que vous venez d'ouvrir et dans lequel vous allez taper vos commandes R pour les conserver. En dessous, la console qui indiquera le déroulement de vos commandes et où vou spouvez aussi taper directement des commandes si vous ne voulez pas les sauvegarder. En haut, à droite, une partie environnement qui vous permet de voir les variables que vous avez créées dans votre espace R ainsi que leur valeur et en dessous, une partie où s'afficheront les graphiques.

Pour que les graphiques s'affichent bien dans la fenêtre en bas à droite  cocher dans le menu de la roue crantée (à côté de Knit) Chunk Output in Console

Placez-vous dans le répertoire contenant les fichiers que vous avez sauvegardés. Aller dans le menu Session puis dans Set Working Directory et vous parcourez votre répertoire jusqu'au dossier correspondant. Faire Open.

Dans la partie fichier, les commandes R doivent être tapez entre ```{r } et ```. Ceci va définir un Chunk qui pourra être évaluer en cliquant sur la flèche verte. Cela correspondont à la commande Run Current Chunk qui évaluera les commandes du Chunk dans lequel le curseur est placé. Cela permet d'éxécuter les commandes du Chunk dont le résultat de l'exécution apparaît dans la partie Console. S'il y a des erreurs dans votre commande, elles vous seront indiquées dans la console. Il faudra alors corriger la commande dans la partie fichier et réévaluer celle-ci en faisant de nouveau Run Current Chunk.
Il est conseillé de découper le script en plusieurs Chunk pour les évaluer au fur et à mesure.
A la fn du TP, n'oublier pas d'enregistrer votre fichier (File, Save).

Pour travailler en phylogénie, il va falloir charger une librairie spécifique, la librairie ape :
```{r }
library(ape)
```
La commande read.tree() permet de lire un arbre dans le format Newick et plot.phylo() permet de déssiner cet arbre. 

Lire l'arbre obtenu avec la distance de Poisson :

tP <- read.tree(file = "ComE_muscle_Poisson_tree.ph")
Le nom du fichier est un exemple, donner celui que vous avez choisi. Cette commande va "mettre" l'abre dans la variable tP qui apparait maintenant dans la fenêtre Environnement. On peut visiualer son contenu en cliquant sur la flèche à côté du nom.
plot.phylo(tP, show.node.label = TRUE, edge.color = "blue", edge.width = 1, no.margin = FALSE, cex=0.8)
title('NJ Poisson')
axisPhylo(side = 1)

La variable tP contiendra les informations concernant votre arbre, avec le nom des feuilles, les longeurs de branches et les labels associés aux noeuds.
L'arbre apparaît dans la fenêtre Plots

Lire l'arbre obtenu avec la distance de Kimura :
tK <- read.tree(file = "ComE_muscle_Kimura_tree.ph")
plot.phylo(tK, show.node.label = TRUE, edge.color = "blue", edge.width = 1, no.margin = FALSE, cex=0.8)
title('NJ Kimura')
axisPhylo(side = 1)

Calculer l'arbre consensus strict (les partitions communes à tous les arbres), 
tC = consensus(tP, tK,rooted=TRUE, p=1)
plot.phylo(tC, cex=0.8, main='Consensus strict between Poisson and Kimura')

Congruence des arbres obtenues avec les distances de Poisson et Kimura

Nous allons utiliser une méthode graphique qui permet de dessiner les deux arbres en vis-à-vis et de relier leur feuilles.

ntips = length(tP$tip.label) # nombre de feuilles dans l'arbre

Créer un tableau associant les feuilles à relier entre les deux arbres (ici elles sont toutes identiques)

association <- matrix(ncol=2, nrow=ntips)
association[,1]<-  tP$tip.label
association[,1] <- sort(association[,1])
association[,2] <- tK$tip.label
association[,2] <- sort(association[,2])
cophyloplot(tP, tK, assoc=association, show.tip.label=FALSE, col = "red", use.edge.length=TRUE)

Pour améliorer le rendu, nous allons utiliser une version modifiée des fonctions mycophyloplot.R et myplotCophylo2.R.
Télécharger et sauvegarder ces fonctions dans votre répertoire. Pour pouvoir les exécuter dans rstudio il faut tout d'abord faire

source("mycophyloplot.R")
source("myplotCophylo2.R")

Puis utiliser la commande :
mycophyloplot(tP, tK, assoc=association, show.tip.label=FALSE, col = "red", use.edge.length=TRUE)

Pour afficher vos graphique de façon plus lisible faire Zoom
Pour sauvegarder vos graphiques faire Export et choisir pdf

Relation entre les distances d'arbres Poisson/ Kimura

La méthode NJ permet de reconstruire un arbre à partir d'une matrice de distances. Afin de comparer les distances inférées sur les arbres, nous allons extraire et  les comparer pour les deux méthodes de distances.

mDisP <- cophenetic(tP)
mDisK <- cophenetic(tK)

Les matrices sont obtenues dans l'ordre des feuilles des arbres, or celui peut varier entre les deux arbres. Comme nous voulons calculer une corrélation entre les paires de distances calculées avec les deux méthodes, nous devons tout d'abord trier les matrices de distances mDisP et mDisK sur les lignes et les colonnes par rapport à l'ordre alphabétique du nom des séquences. Par cette procédure, seules les valeurs des matrices ont été réordonnées mais pas les noms des lignes et des colonnes.

mDisP[rank(colnames(mDisP)),] <- mDisP[c(1:nrow(mDisP)),] # tri sur les noms des colonnes de mDisP
mDisP[,rank(rownames(mDisP))] <- mDisP[,c(1:ncol(mDisP))] # tri sur les noms des lignes de mDisP

mDisK[rank(colnames(mDisK)),] <- mDisK[c(1:nrow(mDisK)),]# tri sur les noms des colonnes de mDisK
mDisK[,rank(rownames(mDisK))] <- mDisK[,c(1:ncol(mDisK))]# tri sur les noms des lignes de mDisK

Comme ces matrices sont symétriques par rapport à la diagonale et que les valeurs de la diagonale sont nulles, nous allons utiliser la fonction as.dist() pour extraire la moitié inferieure gauche de la matrice de distance et éviter ainsi de prendre en compte deux fois les mêmes paires de valeurs ainsi que les valeurs contenues sur la diagonale.

plot(as.dist(mDisP),as.dist( mDisK), pch=20, xlab='Poisson', ylab='Kimura')
abline(0,1, col='red')

Construction des arbres en utilisant une méthode du maximum de vraisemblance

Utiliser la méthode PhyML implémentée dans seaview avec les paramètres par défaut.
Comparer le nouvel arbre avec ceux obtenus précédemment avec la méthode de distance. Voyez-vous des différences? Si oui, cela est-il étonnant ?

Relation entre les distances d'arbres obtenus avec les méthodes NJ (modèle Kimura) et PhyML (modèle LG)

Si vous n'avez plus les variables tP, tK  dans votre environnement faire avant decontinuer :
tP <- read.tree(file = "ComE_muscle_Poisson_tree.ph")
tK <- read.tree(file = "ComE_muscle_Kimura_tree.ph")

Lire l'arbre obtenu avec PhyML :
tLG <- read.tree(file = "ComE_PhyML_LG_tree.ph")

Présentez les deux arbres en vis-à-vis

layout(matrix(1:2, 1, 2))#partitionne la fenêtre graphique (ici en 2  1 ligne et 2 colonnes)
plot.phylo(tK, cex=0.6)
title('NJ Kim')
plot.phylo(tLG, cex=0.6, direction='leftwards')
title('PhyML LG')
layout(1)

Congruence des arbres obtenues avec les distances de Poisson et Kimura

mycophyloplot(tK, tLG, assoc=association, show.tip.label=FALSE, col = "red", use.edge.length=TRUE)

Comparer les distances d'arbres obtenues entre les méthode NJ et PhyML

A faire les 3 commandes suivantes uniqument si vous n'avez plus les variable tK et mDisK dans votre environnement. Sinon, passer directement au traitement pour les distances entre les séquences dans l'arbre obtenu avec PhyML (tLG), en gras ci-dessous.
mDisK <- cophenetic(tK)
mDisK[rank(colnames(mDisK)),] <- mDisK[c(1:nrow(mDisK)),]
mDisK[,rank(rownames(mDisK))] <- mDisK[,c(1:ncol(mDisK))]

mDisLG <- cophenetic(tLG)
mDisLG[rank(colnames(mDisLG)),] <- mDisLG[c(1:nrow(mDisLG)),]
mDisLG[,rank(rownames(mDisLG))] <- mDisLG[,c(1:ncol(mDisLG))]

plot(as.dist(mDisK),as.dist( mDisLG), pch=20, xlab='Kim', ylab='LG', main='cophenetic distances')
abline(0,1, col='red')

Comparaison des bipartitions des trois arbres

tC <- consensus(tP, tK, tLG,rooted=TRUE, p=1)
plot.phylo(tC, cex=0.8)
title('Consensus strict, Poisson, Kimura, PAM, and LG')

Coloriage de l'arbre en fonction de la classe des protéines

Il va falloir transformer le fichier Gene_description_CleanUp.xls qui est au format Excel, en format csv.
Ouvrir le fichier avec LibreOffice puis  Enregistrer sous et choisir le format Texte CSV. Changer le séparateur de champs de , en ;
Enregistrer.

tableau <- read.table("Gene_description_CleanUp-1.csv", header=TRUE, sep=';')
Code couleur pour chaque classe:
codes <- matrix(c('COME', 'BLPR', 'FASA', 'blue', 'red', 'green'), 3,2)
Association de la classe de la protéine (colonne Classification) à une couleur en gardant l'ordre des feuilles dans l'arbre tC.
col <- codes[match(tableau[match(tC$tip, tableau$Gene_Name), 12], codes[,1]), 2]
plot.phylo(tC, cex=0.8, tip.color=col);
legend("bottomleft", legend=codes[,1], col=codes[,2], pch=20)

Coloriage de chacun des 3 arbres obtenus
layout(matrix(1:3,1,3))
col_tP <- codes[match(tableau[match(tP$tip, tableau$Gene_Name), 12], codes[,1]), 2]
plot.phylo(tP,cex=0.6, tip.color=col_tP)
title('NJ Poisson')
col_tK <- codes[match(tableau[match(tK$tip, tableau$Gene_Name), 12], codes[,1]), 2]
plot.phylo(tK,cex=0.6, tip.color=col_tK)
title('NJ Kimura')
col_tLG <- codes[match(tableau[match(tLG$tip, tableau$Gene_Name), 12], codes[,1]), 2]
plot.phylo(tLG,cex=0.6, tip.color=col_tLG)
title('PhyML LG')
layout(1)

Comparer et discuter les trois arbres. Parmi ces 3 arbres, lequel choisireriez-vous ?  Pourquoi ?

Recherche du modèle évolutif le plus adapté à nos données

Pour les M1 Biotech :

Nous allons utiliser un programme installé sur le site serveur atgc de Montpellier.
Cependant, pour exécuter le programme, le fichier de séquences ComE alignés doit être dans un autre format (le format Phylip) que le format fasta que nous avons utiliser pour le sauvegarder précédement. Il faut donc dans seaview ouvrir le fichier ComE_muscle.fst et faire un Save as en choississant le format Phylip. Votre fichier s'appellera ComE_muscle.phy.

Se connecter sur le site http://www.atgc-montpellier.fr/sms/
Après avoir renseigné votre adresse mail, lancer le programme.
Parmi les résultats, seuls ceux des modèles LG, WAG, JTT et Blosum 62 vont nous intéresser. Hormis le modèle Dayhoff dont le modèle JTT est une mise à jour,les autres sont des modèles adaptés à des séquences particulières (mitochondriales, chloroplastiques, de virus).

+G = correction Gamma (nombre de catégories de taux d'évolution de site r fixé à 4)
+F = fréquences des acides aminés à l'équilibre calculées à patir des données (empirical)
+I = proportion des sites invariants estimée à partir des données (estimated)

Par l'analyse des résultats, vous pouvez en déduire le modèle le plus adapté à vos données (voir ci-dessous les explications du critère AIC).

Pour les M1 Bioinfo :

Nous allons installer le programme sur votre ordinateur. Avant sortir de l'environnement conda (conda deactivate).
Aller sur https://github.com/ddarriba/modeltest

Pour le Download faire :

git clone https://github.com/ddarriba/modeltest

Suivre ensuite la procédure Install pour la GUI version :

mkdir build && cd build
cmake -DENABLE_GUI=ON ..
make

Aller ensuite dans bin et lancer ./modeltest-gui
Si vous avez une erreur à l'exécution vous allez installer le programme sans l'interface graphique.
Le récupérer à partir de releases section (Download)(https://github.com/ddarriba/modeltest/releases)
Télécharger la version modeltest-ng-0.1.7 static linux64
Décompresser et désarchiver le fichier.

Pour lancer le programme vous référer au manuel.
ci-dessous un exemple :
./modeltest-ng-static -i ComE_muscle.fst -d aa -h uigf -m JTT,WAG,LG,BLOSUM62
-o ComE__muscle_modeltest_result.out

Dans le fichier résulats,  vous avez plusieurs calculs réalisés suivant différents critères, notamment l'AIC.

  Akaike Information Criterion (AIC).

Lorsque l'on estime un modèle statistique, il est possible d'augmenter la vraisemblance du modèle en ajoutant un paramètre. Le critère d'information d'Akaike permet de pénaliser les modèles en fonction du nombre de paramètres afin de satisfaire le critère de parcimonie. On choisit alors le modèle avec le critère d'information d'Akaike le plus faible.

Dans notre contexte, c'est un estimateur qui correspond à la minimisation de la distance attendue entre un modèle vrai et son estimation. Les modèles correspondant aux valeurs minimales de l'AIC sont considérés comme les plus appropriés pour la reconstruction. Une même topologie de référence doit être utilisée pour tester les différents modèles.

Le critère d'information d'Akaike s'écrit comme la différence entre 2 fois le nombre de paramètres (k) deux fois la log-vraisemblance du modèle estimé.

                                                                                     k = nombre de paramètres libres du modèle

Alignement multiples des séquences homologues a ComD de S. pneumoniae

Réaliser l'alignements multiples des séquences homologues à ComD avec le programme muscle au travers du logiciel seaview comme vous l'avez fait pour ComE.

Vérifier la qualité de l'alignements et effectuer des corrections manuellement si nécessaire. Puis sauvegarder l'alignement.

Recherche du modèle évolutif le plus adapté à nos données

Utiliser la même procédure que pour ComE pour trouver le modèle le mieux adapté aux séquences homologues à ComD.

Construction de l'arbre en utilisant une méthode du maximum de vraisemblance

Utiliser la méthode PhyML implémentée dans seaview en modifiant si nécesaire les paramètres correspondant à la matrice et à la correction gamma. Réorganiser votre arbre si nécessaire (groupe externe, swap des feuilles par rapport à l'arbre obtenu avec ComE). Sauvegarder le en format Newick.

Comparaison des deux arbres obtenus sur ComE et ComD

tComE <- read.tree(file = "ComE_PhyML_LG_edited_ComD.ph")
tComD <- read.tree(file = "ComD_PhyML_LG_edited_ComE.ph")

codes <- matrix(c('COME', 'BLPR', 'FASA', 'blue', 'red', 'green'), 3,2)
col_tComE <- codes[match(tableau[match(tComE$tip, tableau$Gene_Name), 12], codes[,1]), 2]

codes2 <- matrix(c('COMD', 'BLPH', 'FASB', 'FASC', 'blue', 'red', 'green', 'lightgreen'), 4,2)
col_tComD <- codes2[match(tableau[match(tComD$tip, tableau$Gene_Name), 12], codes2[,1]), 2]

layout(matrix(1:2, 1,2))
par(xpd=TRUE, mar=c(8,4,4,3))
plot.phylo(tComE, cex=0.3, tip.color=col_tComE)#si arbre mal dessiné, problème taille des noms versus longueurs des branches. Diminuer la valeur de cex
legend(-0.5,-0.5, legend=codes[,1], col=codes[,2], pch=20, cex=0.55)
title('ComE')

plot.phylo(tComD, cex=0.3, direction='leftwards', tip.color=col_tComD)
legend(1.5,0.5, legend=codes2[,1], col=codes2[,2], pch=20, cex=0.55)
title('ComD')
layout(1)
par()

Analyser les arbres. Conclusions.

Construction d'un arbre espèces en utilisant un ensemble de protéines

Une des approches utilisées pour reconstruire l'arbre phylogénétique d'un ensemble d'espèces consiste à concaténer les alignements obtenus sur un ensemble de gènes ou de protéines conservés dans les génomes de ces espèces (méthode supermatrice). Nous allons illustrer cette approche avec les protéines des petites et grandes sous-unités des ribosomes. Nous avons utilisé les profils COGs de la base de données CD pour annoter les génomes complets de streptocoques à l'aide du programme RPS-BLAST. Nous avons retenu un échantillon de 43 familles de protéines (tableau 2) qui étaient annotées correctement dans la grande majorité des  17 génomes complets de streptocoques. Les séquences du génome de Lactococcus lactis seront utilisées pour enraciner l'arbre.
Pour chaque famille, les séquences des protéines ont été extraites  (Ribo_proteins).

Créer un répertoire Ribo_Proteins et aller dedans :
mkdir Ribo_Proteins
cd Ribo_Proteins
Décompresser le fichier Ribo_proteins.zip :
unzip Ribo_proteins.zip
Illustration

A titre d'illustration, nous allons utiliser seaviewpour aligner avec muscle les 5 premiers fichiers et nous allons calculer les arbres phylogénétiques sur ces fichiers. Sauver vos alignements et réaliser vos arbres avec PhyML (paramètres par défault). 

Que pensez-vous des alignements obtenus?

Que pensez-vous des arbres obtenus?

Recherchons les bipartitions communes à tous ces arbres

t1 <- read.tree(file = "Tree1.ph")
t2 <- read.tree(file = "Tree2.ph")
t3 <- read.tree(file = "Tree3.ph")
t4 <- read.tree(file = "Tree4.ph")
t5 <- read.tree(file = "Tree5.ph")
tC = consensus(t1, t2, t3, t4,t5, p=1)
Qu'avez vous obtenus?

Supprimer l'arbre qui pose des problèmes et recommencer l'opération.

plot.phylo(tC, cex=0.8, main = 'Consensus strict')

Création de l'arbre espèces 

Réouvrir seaview. Ouvrir les fichiers des alignements sauvegardés du premier au dernier. Attention faire toutes les ouvertures à partir de la première fenêtre seaview

Nous allons maintenant concaténer les 5 premiers alignements. Pour cela, placez-vous dans la fenêtre seaview contenant le premier alignement et dans le menu File choisissez Concatenate. Cocher la case add gaps à chaque fois et sélectionner successivement les 4 autres alignements.  La case add gaps  permet aux alignements avec un nombre de séquences plus petit d'être correctement entrés.

Que pensez-vous de l'alignement obtenu?

Nous allons utiliser le pgrogramme Gblocks pour éliminer automatiquement les positions avec une faible ou aucune information phylogénétique. Dans le menu Sites choisir  Create set, puis Gblocks. Dans le menu Gblocks cocher Allow gap positions within final blocks.
Lancer le calcul de l'arbre phylogénétique avec PhyML.


Alignement des 43 familles de protéines

Dans le fichier (super matrix) vous trouverez la concaténation des alignements des 43 familles de protéines.
Calculer un arbre en utilisant la méthode NJ et le modèle de Kimura (100 bootstraps).

Annotation des arbres avec iTOL (Interactive Tree Of Life)

Interactive Tree Of Life : http://itol.embl.de/

Dans la barre de menu en haut de la page, cliquez sur Upload.

Vous pouvez copier/coller votre arbre ou charger le fichier contenant l'arbre en format Newick (d'autres formats sont disponibles).

L’arbre est tracé dans la fenêtre principale. Vous pouvez le déplacer en cliquant dessus et en déplaçant votre souris. A gauche, vous avez des icônes pour zoomer en avant et en arrière.  Opération également possible avec la roulette de la souris.

Modification de l’arbre

Les fonctions principales d’iTOL sont rassemblées dans le panneau de contrôle. Elles sont réparties en quatre catégories (Basic, Advanced, Datasets et Export).

Par défaut et pour des raisons esthétiques, iTOL place les branches avec le plus faible nombre de feuille en haut de l’arbre (mode rectangulaire). Il est possible d’annuler cette option avec Advanced->Leaf sorting.

Vous pouvez modifier l’aspect de l’arbre avec Basic->Display mode. Vous pouvez ajouter les valeurs de bootstraps avec Advanced->Bootstrap.

Export vous permet de générer une image de votre arbre et de son annotation.

Un clique gauche sur les branches de l’arbre, vous donne accès à des fonctions s’appliquant aux nœuds et aux branches. Il est par exemple possible de ré-enraciner l’arbre à la branche sélectionnée (Tree structure->Reroot the tree here).

Annotation des arbres

iTOL offre de nombreuses possibilités d’annotations des arbres. Chaque opération est décrite par un fichier texte, dont le nom doit avoir le suffixe ‘.txt’. L’annotation se fait par glissement (drag-dropping) du fichier dans la fenêtre principale d’iTOL ou par le chargement du fichier à l’aide du bouton + localisé en bas et à droite de la fenêtre.

Le format des fichiers d’annotations est le suivant :

Une première ligne avec un mot clé correspondant au type d’annotation :
TREE_COLORS

La définition du type de séparateur utilisé pour délimiter les informations (TAB, SPACE ou COMMA).
SEPARATOR TAB

Un ensemble de paramètres globaux qui vont définir l’aspect global de l’annotation.
Le mot clé DATA indique le début des annotations. 

Annotation de ComE

 Exemple 1 (RR_color_class_range_cover.txt) : coloriage des sous arbres correspondant aux familles de gènes

Chaque sous arbre est définit par le dernier ancêtre commun des feuilles correspondantes,  à l’aide de deux labels de feuilles séparés par ‘|’. Plusieurs combinaisons de pairs de feuilles donnent le même résultat. Le mot range définit le type de coloriage à réaliser (l’arrière-plan du sous arbre).

TREE_COLORS
SEPARATOR TAB
DATA
SaurA01.AGRA|SepiA01.AAO05237.1   range       #80f31f    AGRA
SgorA01.COME|SpneA01.COME           range       #3541fe   COME
SubeA01.CAR41219.1|SsalA01.RR09     range       #ca039c   BLPR
SsalA01.CCB96178.1|SpyoA01.AAK33322.1         range       #078eec   FASA

Après chargement du fichier, il est possible de modifier le type de coloriage avec Cover dans la fenêtre associée à cette annotation (label, clade, full, ou off). En cliquant sur la roue crantée, vous pouvez modifier la couleur de chaque clade (Datasets dans la fenêtre de contrôle).

Exemple 2 (RR_replace_tips_by_Code.txt) : remplacement du nom des feuilles.
A chaque feuille est associé un nouveau nom.

LABELS
SEPARATOR TAB
DATA
SaurA01.AGRA      SaurRR1
SepiA01.AAO05237.1             SepiRR1
SequA01.ACG62860.1            SequRR2
…

Exemple3 (RR_protein_domains.txt) : annotation des domaines Pfam.
La longueur de la protéine est indiquée et à la suite, chaque domaine est décrit par une forme (HH), un début et une fin dans la séquence, une couleur et un label.

DATASET_DOMAINS
SEPARATOR
TAB
DATASET_LABEL Domains_Pfam
COLOR   #0000ff
DATASET_SCALE 100-amino_acid_100-#0000ff  500-line at aa500-#ff0000        1000-aa1000-#00ff00
DATA
SaurA01.AGRA      238          HH|3|121|#7300ff|pfam00072  RE|149|237|#0000ff|pfam04397
SepiA01.AAO05237.1             238          HH|3|121|#7300ff|pfam00072              RE|149|238|#0000ff|pfam04397
StheA01.ABJ66794.1           245          HH|34|120|#7300ff|pfam00072 RE|145|237|#0000ff|pfam04397
SubeA01.CAR41219.1            246          HH|3|127|#7300ff|pfam00072               RE|146|233|#0000ff|pfam04397
SubeA01.FASA       245          HH|3|114|#7300ff|pfam00072  RE|152|242|#0000ff|pfam04397
…

Annotation de ComD

Exemple 4 (HK_color_class_strips.txt) : ajout d'une colonne avec les familles des protéines

Exemple 5 (HK_replace_tips_by_Code.txt) : remplacement du nom des feuilles par un code.

Exemple 6 (HK_protein_domains.txt) : annotation des domaines Pfam.

Annotation de l'arbre des espèces avec iTOL

Exemple 7 (AE_replace_tips_by_species.txt) : remplacement du nom des feuilles par l'espèce

Exemple 8 (AE_color_taxonomy_range.txt) : coloriage des sous arbres correspondant rang taxonomique.

Exemple 9 (AE_family_distribution.txt) : distribution phylogénétique des familles.