Identification
d'une nouvelle
espèce de bactérie
Cet exemple est basé sur une publication d'Hantsis-Zacharov
et Halpern
(2007). Les auteurs ont étudié les bactéries
tolérantes au sels dans le
lait cru. Sur un ensemble de 300 cultures pures, ils ont isolé
une
souche de Chryseobacterium
appelée H38T. Afin d'identifier et de caractériser cette
souche, ils
ont réalisé une analyse comparative de son ARNr 16S et
une analyse
phénotypique comparative avec les espèces de Chryseobacterium déjà
connues. Nous nous intéresserons ici uniquement à
l'analyse de l'ARNr 16S.
Un fragement interne du gène codant pour l'ARNr 16S a
été obtenu par PCR à l'aide de deux primers
"universels":
8f
5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG- 3'
1512r 5'-TACGGTTACCTTGTTACGAC-3'
Le produit de l'amplification d'environ 1,5 kb a été
purifié et séquencé (H38T.fts).
Les auteurs ont utilisé la banque de données EMBL et le
programme Wu
Questions
- A l'aide de RDP, vérifiez l'universalité
des deux primers. Les valeurs 8 et 1512 correspondent à la
positions de ces primers dans la séquence d'E. coli. Vous pouvez faire varier
le nombre d'erreurs que vous acceptez.
- Utilisez le Classifier
pour obtenir un assignement taxonomique de votre séquence.
- Utilisez Sequence Match
pour construire un fichier avec les séquences voisines de H38T.
Dans un premier temps, utilisez uniquement les séquences
"Types". Sétectionner les séquences et les charger dans SeqCART.
Pour que votre séquence soit ajoutée à
l'alignement, il faut tout d'abord qu'elle soit alignée avec les
séquences d'ARNr 16S de la base de donnée et ensuite
ajoutée au SeqCART. Ceci est réalisé grâce
à myRDP (page d'accueil de la RDP) que vous lancerez avec Test Drive.
- commencez par
un upload de votre
séquence, qui sera alignée,
- ouvrir ensuite son projet et sélectionner la séquence alignée,
- puis terminez par un download
de votre séquence et de ses voisines contenues dans SeqCART
(format FASTA avec les AC GenBank).
- Reprenez le fichier avec l'éditeur de
séquences seaview.
Vérifiez l'alignement multiple et si besoin est, optimisez le
positionnement des insertions/délétions.
- Réalisez un arbre phylogénétique .
Vous pouvez utiliser une méthode de distance et PhyML.
- Evaluez la signification des différentes branches
des arbres obtenus (valeur de bootstrap).
- Vous allez maintenant utiliser leBIBI pour réaliser
l'identification. récupérer
- Que pensez-vous des résultats obtenus?
- Recommencez Sequence
Match mais sans restriction sur les souches. Comme
vous pouvez l'observer votre séquence est déjà
dans la base de données (S000805862).
- Recommencez les différentes étapes
(l'extraction de fichier n'a pas besoin de passer par myRDP, votre
séquence appartient déjà à l'alignement).
Analyse
de communautées microbiennes (métagénomique)
Nous allons nous intéresser à la
composition et à la structure des communautées
bactériennes impliquées dans l'extraction des
métaux (bioleaching).
Les échantillons analysés (K1 et K2) ont
été prélevés au niveau des eaux de drainage sur deux sites d'une mine de
cuivre de Tong Shankou en Chine (Xie
et al., 2007).
Les deux sites présentent les mêmes
caractéristiques générales, avec des pH de 2-5 et
une température moyenne d'environ 25°C mais possèdent
des concentrations différentes pour un certain nombre
d'éléments chimiques simples :
Eléments |
Echantillon K1 |
Echantillon K2 |
Fer |
1300 |
545 |
Cuivre |
990 |
374.4 |
Sulfure |
2060 |
1610 |
Calcium |
459.1 |
516 |
Aluminium |
275.9 |
284.9 |
Silice |
50.4 |
90.7 |
Aspartate |
3.5 |
2.6 |
Argent |
0.5 |
0.01 |
Bismuth |
9.4 |
18.7 |
Indium |
4.7 |
0.01 |
Les micro environnements naturels extrêmement acides (AMD) ont
pour origine la dissolution de roches contenant des sulfides quand
elles se retrouvent exposées à l'air, à l'eau et
aux microorganismes. L'utilisation de microorganismes dans
l'exploitation minière (biosolubilisation des métaux
à partir de minerais) conduit à une augmentation
artificielle de ces micro environnements acides qui peut
générer des problèmes environnementaux. à
plus grande échelle. Plusieurs facteurs affectent la
création et l'évolution de ces AMD : les minéraux
présents, le type de roche, la température, mais
également la présence de bactéries oxydatrices du
fer comme Acidithiobacillus ferrooxidans et Leptospirillum ferrooxidans.
Les études les plus récentes montrent que tous les AMD
présentent une écologie microbienne complexe incluant au
moins huit divisions de bacteria et au moins trois divisions d'archaea (Thermoplasma, Ferroplasma et Sulfolobales).
Les comunautées bactériennes ont été
amplifiées par PCR à l'aide de deux paires de primers
"universels":
27f
5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'
1492r 5'-CGGCTACCTTGTTACGACTT-3'
et
S20 5'-ACGGGGCGCAGCAGGCGCGA-3'
A21 5'-ACGGCTACCTTGTTACGACTT-3'
Après purification, les produits de PCR ont été
séquencés. Les séquences des deux sites sont
disponibles dans les fichiers Copper_Mine.K1
et Copper_Mine.K2.
Questions
- Pour quelles raisons les auteurs ont utilisé deux
paires de primers?
- Utilisez le programme Bellerophon afin
de vérifier la qualité des deux échantillons
de séquences. Les résultats vous sont envoyés par
courrier électronique. En attendant de les recevoir vous pouvez
les consulter ici 12.
- Utilisez le serveur RDP
pour comparer la distribution taxonomique des deux échantillons
de séquences.
- Commentez les résultats.
- Quelles sont les espèces les plus
fréquentes sur les deux sites?
Nous allons réaliser une analyse
phylogénétique un peu plus poussée avec les
séquences d'archaea
- Construire un fichier avec les séquences d'archaea extraites des deux fichiers Copper_Mines.K1 et Copper_Mine.K2.
- Utiliser Sequence Match
pour construire un fichier avec les séquences voisines des séquences d'archaea (on choisira les souches types).
- Comme précédemment, créer votre projet myRDP
pour obtenir les séquences d'archaea des deux
échantillons alignées avec les séquences d'ARNr
16S de la RDP. Ajouter ensuite les séquences voisines de votre
SeqCart et récupérer l'ensemble (format FASTA, AC
Genbank).
- Charger l'alignement dans Seaview, le vérifier et
construire un arbre avec par exemple la méthode BioNJ et le
modèle évolutif Kimura 2 paramètres (rapide)
- Analyser les résultats en les comparant avec ceux
que vous avez obtenus avec le classifier de la RDP à
l'étape précédente.
- Rechercher des informations sur les espèces d'archaea identifiées dans les deux sites.
Réaliser la même étude mais avec les
séquences de bactéries présentes dans les deux
échantillons
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