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L2-L3 Bioinfo - TP Traitement d'images 1h20

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TP1 - Traitement d'images

Exercice 1 : Premier pas dans la segmentation par seuillage

  1. Enregistrez l'image suivante (en notant où vous l'enregistrez) A4-dapi.tif puis ouvrez-la avec ImageJ.
  2. Sachant que 10 microns est égal à 90 pixels, calibrez votre image en changeant la taille du pixel et l'unité de mesure (micron) dans le menu Analyze → Set Scale.
  3. Dupliquez l'image avant de commencer la segmentation par seuillage de l’image.
  4. Réalisez une segmentation par seuillage sur l'image dupliquée avec Image → Adjust → Threshold. Les pixels "objets" seront en rouges et les pixels de "fond" seront" en noirs.
  5. Après avoir déterminé le seuil optimal afin que l’ensemble des noyaux soient rouges, appuyer sur APPLY pour binariser l’image.
  6. Avant de lancer une analyse d’objet de votre image binarisée, il est important d’indiquer au logiciel les mesures à réaliser parmi plusieurs choix. Pour cela, choisissez les paramètres à mesurer dans Analyze → Set Measurements tels que : l’aire, le périmètre et l'intensité moyenne (Mean grey value).
  7. Dans un premier temps, vous aller lancer une analyse de tous les objets présents dans l'image binarisée avec Analyze → Analyze Particles. Cochez les options permettant (i) d’afficher les résultats (ii) effacer les anciens résultats et (iii) add to Manager ». Est ce que l’option "Exclude on Egdes » est nécessaire ?
  8. Est-ce que tous les objets détectés par le logiciel sont des noyaux ? Relancer Analyze Particles et utiliser le champs Size (pixel^2), qui par défaut est 0 - infinity, pour restreindre la recherche des objets selon leurs surfaces.
  9. Les mesures de l’air et du périmètre sont-elles satisfaisantes ? Et les mesures de l’intensité relative de fluorescence ? Dans quelle image est l’information de l’intensité de fluorescence des noyaux ?
  10. Fermer la fenêtre Results
  11. Dans la fenêtre ROI Manager, cliquez sur show all afin d’appliquer les masques de l’image binarisée sur l’image d’origine puis cliquer sur Measure. Les mesures de l’intensité relative de fluorescence sont-elles maintenant satisfaisantes ?


Notion de MACRO

Exercice 2: Pour l’instant, c’est simple

Nous allons créer une macro qui permet d’enchaîner les opérations suivantes : Ouverture de l’image A4_Dapi => Segmentation par seuillage de l’image => mesure des surfaces des noyaux.

  1. Allez dans Plugins/Macros/Record
  2. Ouvrir l’image A4_DAPI.tif. Observez la ligne de code dans la fenêtre ”Macro record”
  3. calibrer votre image comme précédemment
  4. Segmenter l’image pour sélectionner uniquement les noyaux
  5. Analyze/Set Measurements => choisir l’aire
  6. Analyze/Analyze particles
  7. Enregistrez votre macro via la fenêtre « Recorder » en cliquant sur Create puis File>
  8. Save as> EssaiMacro.txt
  9. Tester votre macro après avoir fermé toutes les fenêtres du logiciel puis Plugins>Macros>Run> EssaiMacro


Traitement semi-automatique d’images de fluorescence de la chlorophylle d’Arabidopsis thaliana.

Arabidopsis thaliana ou encore "Arabette des Dames" souvent considérée comme la mauvaise herbe des jardiniers est une plante herbacée de la famille des Brassicacées (crucifère) de 10-15cm de haut à l’état adulte. A. thaliana est formée d'une rosette de feuilles de 2 à 5 cm de diamètre située au ras du sol dont se détachent les racines et un pédoncule floral portant l’inflorescence.

Première plante séquencée en 2000, A. thaliana, dit "Arabette" dans les laboratoires, est une espèce modèle pour les biologistes. En effet Arabette est facile à manipuler en laboratoire car elle est de petite taille et des centaines de pieds et des milliers de graines peuvent être obtenus sur des surfaces de dimensions modestes en quelques mois. De plus, Arabette possède un petit génome, comparé à celui des plantes à fleurs, avec cinq paires de chromosomes et environ 25 000 gènes.

Comme toutes les plantes, Arabette est soumise à différentes contraintes abiotiques (froid, sécheresse) ou biotiques (maladies bactériennes ou fongiques) qui peuvent affecter son développement et donc sa survie. L’idée de l’ensemble de ces TP est de caractériser les acteurs moléculaires qui pourraient faciliter la croissance d’Arabidopsis lorsqu’elle est infectée par une bactérie pathogène en utilisant différents types d’outils et de méthodes allant de l’analyse d’image à la modélisation.

Pour cela, vous utiliserez des données d’un laboratoire de recherche qui a mis en culture dans des pots individuels, 75 sous-espèces d’Arabette provenant de différents endroits du globe. Une fois le stade adulte atteint, des bactéries pathogènes ont été pulvérisées sur les feuilles. Puis, des acquisitions de la fluorescence chlorophyllienne ont été réalisées 15 jours après la pulvérisation pour chacune des sous-espèces.

Vous aurez chacun·e 5 images différentes à traiter, correspondant à 5 sous-espèces traitées par des bactéries. Vous pouvez créer une macro permettant d’avoir la surface foliaire totale pour chacune des images de votre série. La calibration des images est de 33 pixels = 1cm. Les données de la surface foliaire est à entrer sur le fichier Google-Sheet TP_L2S4_Bioinfo.