M2R BV
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Afin d’identifier les autres régions de CBEL reconnues par la plante hôte, on se propose de réaliser des délétions sériées de la molécule et de tester l’activité des molécules par expression transitoire dans des feuilles de Tabac. Pour cela, on va dans un premier temps cloner CBEL dans le vecteur d’expression pVX (virus X de la pomme de terre) pour obtenir le vecteur pVX-CBEL. | Afin d’identifier les autres régions de CBEL reconnues par la plante hôte, on se propose de réaliser des délétions sériées de la molécule et de tester l’activité des molécules par expression transitoire dans des feuilles de Tabac. Pour cela, on va dans un premier temps cloner CBEL dans le vecteur d’expression pVX (virus X de la pomme de terre) pour obtenir le vecteur pVX-CBEL. | ||
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| - | La carte du plasmide pVX et son site multiple de clonage (MCS), ainsi que la séquence partielle (MCS + insert CBEL) du plasmide pBSK_CBEL sont disponibles. | + | La carte du plasmide pVX et son site multiple de clonage (MCS), ainsi que la séquence partielle (MCS + insert CBEL) du plasmide pBSK_CBEL sont [[M2R_BV_clonage_cartes|disponibles ici]]. |
Revision as of 09:01, 9 September 2014
Introduction
Le but de ce TD est de se familiariser avec les concepts et les outils de biologie moléculaire nécessaires à l’analyse de séquences nucléiques. Ces approches vous seront utiles pendant le M2R BioSciences Végétales dans le cadre de l’analyse de publications scientifiques et/ou au cours de votre stage. Les exercices s’appuient sur une étude menée actuellement sur le campus Toulousain dans l’UMR5546 et font appel aux moyens disponibles sur le site du Pôle de Biotechnologie Végétale de Toulouse. Ainsi l’ensemble des outils utilisés au cours de ce travail sera accessible depuis les ordinateurs de vos différentes équipes d’accueil du M2R.
pDRAW (http://www.acaclone.com/) sera utilié comme logiciels pour ce TD, d'autres logiciels (exemple: Serial Cloner http://serialbasics.free.fr/Serial_Cloner.html, CLC http://www.clcbio.com/products/clc-main-workbench/) seront également disponibles dans vos équipes d'accueil.
Contexte Scientifique du TD
Une étude biochimique a permis d’isoler une protéine pariétale de l’oomycète Phytophthora parasitica, parasite racinaire de nombreuses solanacées. Cette protéine, nommée CBEL, est reconnue par la plante (=effecteur), entraînant une mort localisée de certaines cellules végétales. Cette reconniassance est liée à la présence de 2 motifs de fixation à la cellulose ou CBD (Cellulose Binding Domain). Afin d’identifier les autres régions de CBEL reconnues par la plante hôte, on se propose de réaliser des délétions sériées de la molécule et de tester l’activité des molécules par expression transitoire dans des feuilles de Tabac. Pour cela, on va dans un premier temps cloner CBEL dans le vecteur d’expression pVX (virus X de la pomme de terre) pour obtenir le vecteur pVX-CBEL.
Différentes étapes seront réalisées pour mener à bien ce projet.
Etape 1 : choix des enzymes de restriction adaptées pour le clonage dans le vecteur pVX Etape 2 : création d'une carte du plasmide pVX-CBEL Etape 3 : identification in silico des clones recombinants positifs Etape 4 : définition d'amorce Etape 5 : séquençage Etape 6 : analyse des résultats
Etape 1: choix des enzymes de restriction adaptées pour le clonage dans le vecteur pVX
L'ADNc pleine taille de CBEL est présent dans un vecteur nommé pBlueScript_SK (pBSK), présentant un gène codant une résistance à l’ampicilline.
La carte du plasmide pVX et son site multiple de clonage (MCS), ainsi que la séquence partielle (MCS + insert CBEL) du plasmide pBSK_CBEL sont disponibles ici.
Q1
- Décrire les principales étapes du clonage à réaliser.
- Indiquez comment vous sélectionnez les clones recombinants.
