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==Etape 1: choix des enzymes de restriction adaptées pour le clonage dans le vecteur pVX==
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L'ADNc pleine taille de CBEL est présent dans un vecteur nommé pBlueScript_SK (pBSK), présentant un gène codant une résistance à l’ampicilline.
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- L'ADNc pleine taille de CBEL est présent dans un vecteur nommé pBlueScript_SK (pBSK), présentant un gène codant une résistance à l’ampicilline.
La carte du plasmide pVX et son site multiple de clonage (MCS), ainsi que la séquence partielle (MCS + insert CBEL) du plasmide pBSK_CBEL sont [[M2R_BV_clonage_cartes|disponibles ici]].  
La carte du plasmide pVX et son site multiple de clonage (MCS), ainsi que la séquence partielle (MCS + insert CBEL) du plasmide pBSK_CBEL sont [[M2R_BV_clonage_cartes|disponibles ici]].  
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*Décrire les principales étapes du clonage à réaliser.  
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*Indiquez comment vous sélectionnez les clones recombinants.
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- Afin d’identifier les sites de restriction compatible entre l’insert CBEL et le vecteur de clonage pVX, nous allons visualiser les cartes de restriction des différents plasmides en utilisant le logiciel pDRAW32 déjà installé sur vos ordis.
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    [[Utilisation de pDRAW]]
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    Enregistrez sur votre ordi puis ouvrir dans pDRAW le fichier test nommé [[Media:pATS_CBEL.PDW|pATS_CBEL.PDW]]. NB : les fichiers lisibles dans pDRAW présentent l'extension .PDW
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    Tester les différents fonctions de pDRAW (DNA linear, circular, restriction enzyme...)
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*En utilisant les séquences de pBSK_CBEL et du MCS de PVX, identifier des sites de restriction compatible pour le clonage.
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*Sauvegarder pour la suitedu TD, la carte du MCS_insert CBEL de pBSK (fichier : MCS_pBSK_CBEL.pdw).
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==Etape 2: création d'une carte du plasmide pVX-CBEL==
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L'identification des clones recombinants contenant l'insert d'interet CBELpeut s'effectuer à la paillasse par une digestion enzymatique des clones candidats pVX_CBEL.
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Pour prédire la taille des inserts libérés par digestion, il faut définir la carte du plasmide pVX_CBEL via pDRAW, et ensuite réalisé une digestion 'in silico' avec les enzymes adéquates.
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    Enregistrez sur votre ordinateu, puis ouvez dans pDRAW carte du plasmide [[Media:pVX.PDW|pVX]].
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    Repérez le zone du MCS afin de vérifier ensuite votre clonage
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    Puis dans File, New, Cloning of sequences
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    First Fragment, Use current Open File (soit le vecteur PVX), sélectionner ensuite, 5’ cut : NotI, 3’ cut : ClaI, DNA is circular
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    Cliquez sur Second Fragment, Import Fragment (rechercher votre carte MCS_pBSK_CBEL.pdw) , sélectionner ensuite 5’ cut : ClaI, 3’ cut : NotI, décocher DNA is circular
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    Cliquez sur OK : pour vérifier que votre carte plasmidique est correcte, vous devez retrouver les sites de restriction et CBEL positionné dans le MCS.
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    Changer le nom de votre plasmide par : PVX_CBEL et sauvegarder la carte sous le nom PVX_CBEL

Revision as of 12:35, 9 September 2014

Contents

Introduction

Le but de ce TD est de se familiariser avec les concepts et les outils de biologie moléculaire nécessaires à l’analyse de séquences nucléiques. Ces approches vous seront utiles pendant le M2R BioSciences Végétales dans le cadre de l’analyse de publications scientifiques et/ou au cours de votre stage. Les exercices s’appuient sur une étude menée actuellement sur le campus Toulousain dans l’UMR5546 et font appel aux moyens disponibles sur le site du Pôle de Biotechnologie Végétale de Toulouse. Ainsi l’ensemble des outils utilisés au cours de ce travail sera accessible depuis les ordinateurs de vos différentes équipes d’accueil du M2R.

pDRAW (http://www.acaclone.com/) sera utilié comme logiciels pour ce TD, d'autres logiciels (exemple: Serial Cloner http://serialbasics.free.fr/Serial_Cloner.html, CLC http://www.clcbio.com/products/clc-main-workbench/) seront également disponibles dans vos équipes d'accueil.

Contexte Scientifique du TD

Une étude biochimique a permis d’isoler une protéine pariétale de l’oomycète Phytophthora parasitica, parasite racinaire de nombreuses solanacées. Cette protéine, nommée CBEL, est reconnue par la plante (=effecteur), entraînant une mort localisée de certaines cellules végétales. Cette reconniassance est liée à la présence de 2 motifs de fixation à la cellulose ou CBD (Cellulose Binding Domain). Afin d’identifier les autres régions de CBEL reconnues par la plante hôte, on se propose de réaliser des délétions sériées de la molécule et de tester l’activité des molécules par expression transitoire dans des feuilles de Tabac. Pour cela, on va dans un premier temps cloner CBEL dans le vecteur d’expression pVX (virus X de la pomme de terre) pour obtenir le vecteur pVX-CBEL.

Différentes étapes seront réalisées pour mener à bien ce projet.

   Etape 1 : choix des enzymes de restriction adaptées pour le clonage dans le vecteur pVX
   Etape 2 : création d'une carte du plasmide pVX-CBEL
   Etape 3 : identification in silico des clones recombinants positifs
   Etape 4 : définition d'amorce
   Etape 5 : séquençage
   Etape 6 : analyse des résultats

Etape 1: choix des enzymes de restriction adaptées pour le clonage dans le vecteur pVX

- L'ADNc pleine taille de CBEL est présent dans un vecteur nommé pBlueScript_SK (pBSK), présentant un gène codant une résistance à l’ampicilline.

La carte du plasmide pVX et son site multiple de clonage (MCS), ainsi que la séquence partielle (MCS + insert CBEL) du plasmide pBSK_CBEL sont disponibles ici.


Q1

  • Décrire les principales étapes du clonage à réaliser.
  • Indiquez comment vous sélectionnez les clones recombinants.


- Afin d’identifier les sites de restriction compatible entre l’insert CBEL et le vecteur de clonage pVX, nous allons visualiser les cartes de restriction des différents plasmides en utilisant le logiciel pDRAW32 déjà installé sur vos ordis.

   Utilisation de pDRAW
   Enregistrez sur votre ordi puis ouvrir dans pDRAW le fichier test nommé pATS_CBEL.PDW. NB : les fichiers lisibles dans pDRAW présentent l'extension .PDW
   Tester les différents fonctions de pDRAW (DNA linear, circular, restriction enzyme...)

Q2

  • En utilisant les séquences de pBSK_CBEL et du MCS de PVX, identifier des sites de restriction compatible pour le clonage.
  • Sauvegarder pour la suitedu TD, la carte du MCS_insert CBEL de pBSK (fichier : MCS_pBSK_CBEL.pdw).


Etape 2: création d'une carte du plasmide pVX-CBEL

L'identification des clones recombinants contenant l'insert d'interet CBELpeut s'effectuer à la paillasse par une digestion enzymatique des clones candidats pVX_CBEL. Pour prédire la taille des inserts libérés par digestion, il faut définir la carte du plasmide pVX_CBEL via pDRAW, et ensuite réalisé une digestion 'in silico' avec les enzymes adéquates.

   Utilisation de pDRAW pour créer des cartes de plasmide
   Enregistrez sur votre ordinateu, puis ouvez dans pDRAW carte du plasmide pVX.
   Repérez le zone du MCS afin de vérifier ensuite votre clonage
   Puis dans File, New, Cloning of sequences
   First Fragment, Use current Open File (soit le vecteur PVX), sélectionner ensuite, 5’ cut : NotI, 3’ cut : ClaI, DNA is circular
   Cliquez sur Second Fragment, Import Fragment (rechercher votre carte MCS_pBSK_CBEL.pdw) , sélectionner ensuite 5’ cut : ClaI, 3’ cut : NotI, décocher DNA is circular
   Cliquez sur OK : pour vérifier que votre carte plasmidique est correcte, vous devez retrouver les sites de restriction et CBEL positionné dans le MCS.
   Changer le nom de votre plasmide par : PVX_CBEL et sauvegarder la carte sous le nom PVX_CBEL