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TD4 Bioanalyse

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(Exercice 2 : recherche de protéines homologues à BCL2 humaine)
(Exercice 1 : recherche d'homologues avec BlastN)
 
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= Exercice 1 : recherche d'homologues avec BlastN=
= Exercice 1 : recherche d'homologues avec BlastN=
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'''1/''' A partir de la séquence de l'ARNm de l'isoforme 1 (NM_000633), lancer un BLASTN contre la banque nr (cochez la case Exclude models XM/XP)<br>
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'''1/''' A partir de la séquence de l'ARNm de l'isoforme alpha (NM_000633), lancer un BLASTN contre la banque '''''nucleotide collection nr/nt''''' (cochez la case Exclude models XM/XP)<br>
'''2/''' Regardez le résultat du BLAST et répondez aux questions suivantes :
'''2/''' Regardez le résultat du BLAST et répondez aux questions suivantes :
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'''4/''' Des alignements avec des E-value >1 vous semblent-ils être de bons alignements ?
'''4/''' Des alignements avec des E-value >1 vous semblent-ils être de bons alignements ?
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''En fait, on travaillera plutôt au niveau protéique pour chercher des homologues, pour les raisons déjà vues au TP2 (conservation uniquement des CDS, pas sur les UTR, pas de problème de variation d'usage des codons donc taux d'identité plus élevé, et notion de similarité des acides aminés)
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'''5/''' Lancer un BLASTX toujours sur le même organisme et contre le banque nr : intérêt(s) de BLASTX ?
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''
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''En fait, on travaillera plutôt au niveau protéique pour chercher des homologues, pour les raisons déjà vues au TP2 (conservation uniquement des CDS, pas sur les UTR, pas de problème de variation d'usage des codons donc taux d'identité plus élevé, et notion de similarité des acides aminés). Ici on connait la protéine donc mieux vaut faire un BLASTP qu'un BLASTX''
=Exercice 2 : recherche de protéines homologues à BCL2 humaine=
=Exercice 2 : recherche de protéines homologues à BCL2 humaine=
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*combien y a-t-il d'événement d'insertion-délétion ? <br>
*combien y a-t-il d'événement d'insertion-délétion ? <br>
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'''3/''' Sélectionner (en cochant les cases dans le tableau) les séquences qui vous semblent homologues à notre séquence (prenez une vingtaine de séquences, a priori correspondant aux lignes rouges ou roses)<br>
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'''3/''' Sélectionner les séquences qui vous semblent homologues à notre séquence (filtre avec alignement sur les 2/3 de la séquence query, et identité à plus de 30%)<br>
'''4/''' Récupérer les séquences en cliquant sur GenPept puis FASTA text.<br>
'''4/''' Récupérer les séquences en cliquant sur GenPept puis FASTA text.<br>
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'''5/''' Copier les séquences dans un editeur de texte et '''renommer les pour avoir des noms courts''' : changer le nom dans l'entête FASTA, en gardant nom de protéine et de l'organisme, et sans espace (mais des tirets - ou _) <br>
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'''5/''' Copier les séquences dans un editeur de texte et '''renommer les pour avoir des noms courts''' : changer le nom dans l'entête FASTA, en gardant nom de protéine et de l'organisme, et sans espace (utilisez plutôt des 'tirets' _ ou -) <br>
Vous pouvez garder le nom fourni dans SwissProt. Par exemple : <br>
Vous pouvez garder le nom fourni dans SwissProt. Par exemple : <br>
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>gi|231632|sp|P10415.2|BCL2_HUMAN RecName: Full=Apoptosis regulator Bcl-2 <br>
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>sp|P10415.2|BCL2_HUMAN RecName: Full=Apoptosis regulator Bcl-2 <br>
devient :<br>
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>BCL2_HUMAN
>BCL2_HUMAN
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= Exercice 3 : recherche d'homologues chez le nématode (''Caenorhabditis'')=
= Exercice 3 : recherche d'homologues chez le nématode (''Caenorhabditis'')=
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exo supprimé !!
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Le nématode étant assez éloigné de l'homme il n'y avait probablement pas de séquences dans le BLASTP précédent. <br>
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Le nématode étant assez éloigné de l'homme il n'y avait probablement pas de séquences de nématode dans le résultat de BLASTP <br>
Vous allez maintenant utiliser le programme '''PsiBLAST''' pour chercher des homologues chez cet organisme
Vous allez maintenant utiliser le programme '''PsiBLAST''' pour chercher des homologues chez cet organisme
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'''1/''' A partir de la protéine précédente, sélectionner la '''banque nr''' cette fois, préciser l'organisme Caenorhabditis et choisir PsiBLAST dans la sélection des programmes de BLASTP. <br>
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'''1/''' A partir de la protéine précédente, sélectionner la '''banque nr''', préciser l'organisme Caenorhabditis et choisissez PsiBLAST dans la sélection des programmes de BLASTP. <br>
'''2/''' Sélectionner les séquences qui s'alignent sur la zone du domaine BCL2-like (cocher ou décocher les cases à droite) et lancer la 2e itération <br>
'''2/''' Sélectionner les séquences qui s'alignent sur la zone du domaine BCL2-like (cocher ou décocher les cases à droite) et lancer la 2e itération <br>
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'''3/''' Observer les changements dans les résultats. Sélectionner les premières séquences, toujours alignées sur le domaine BCL2-like. Ne prenez pas les séquences de PDB (numéro d'accession commence par un chiffre). Si vous le souhaitez, lancer une seconde itération. <br>
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'''3/''' Observer les changements dans les résultats. Sélectionner les premières séquences, toujours alignées sur le domaine BCL2-like. Ne prenez pas les séquences de PDB (numéro d'accession commence par un chiffre). 1 séquence par organisme suffit !<br>
'''4/''' Rajouter ces quelques séquences à votre jeu de séquences précédent, en les renommant également.
'''4/''' Rajouter ces quelques séquences à votre jeu de séquences précédent, en les renommant également.
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= Exercice 3 : Alignement multiple et construction d'une signature protéique =
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= Exercice 4 : Alignement multiple et construction d'une signature protéique =
'''1/''' Sur le site de l'EBI utiliser [http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/mafft/ '''MAFFT'''] pour construire un alignement multiple (choisir Output format : ClustalW) : regarder l'alignement, et garder cette page ouverte ! <br>
'''1/''' Sur le site de l'EBI utiliser [http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/mafft/ '''MAFFT'''] pour construire un alignement multiple (choisir Output format : ClustalW) : regarder l'alignement, et garder cette page ouverte ! <br>
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'''2/''' Visualiser l'alignement (onglet Result Viewers) soit avec Jalview (sur les PC, dans Programmes) soit avec Mview (en ligne) : regarder l'alignement. Jalview ou Mview sont juste des interfaces de visualisation. Où sont les parties conservées ? Voyez-vous apparaitre des groupes de séquences ? <br>
'''2/''' Visualiser l'alignement (onglet Result Viewers) soit avec Jalview (sur les PC, dans Programmes) soit avec Mview (en ligne) : regarder l'alignement. Jalview ou Mview sont juste des interfaces de visualisation. Où sont les parties conservées ? Voyez-vous apparaitre des groupes de séquences ? <br>
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'''2/''' Visualiser l'alignement (onglet Result Viewers) avec '''Mview'''. Mview est juste une interface de visualisation. Où sont les parties conservées ? Voyez-vous apparaitre des groupes de séquences ? <br>
 
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'''2/''' Visualiser l'alignement (onglet Result Viewers) avec Mview (en ligne) : regarder l'alignement. Mview est juste une interface de visualisation. Où sont les parties conservées ? Voyez-vous apparaitre des groupes de séquences ? <br>
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'''3/''' Copier le même alignement (Onglet Result Summary => fichier output) dans [http://weblogo.berkeley.edu/logo.cgi '''WebLogo'''] : modifier le paramètre '''Logo range''' pour cibler la zone conservée (voir selon votre alignement) et '''''Logo Size per Line''''' : 40 x 5 cm <br>
'''3/''' Copier le même alignement (Onglet Result Summary => fichier output) dans [http://weblogo.berkeley.edu/logo.cgi '''WebLogo'''] : modifier le paramètre '''Logo range''' pour cibler la zone conservée (voir selon votre alignement) et '''''Logo Size per Line''''' : 40 x 5 cm <br>
'''4/''' Construire une signature PROSITE à partir de votre alignement (n'utilisez pas le LOGO, sinon vous ne voyez pas précisément les zones de gap)
'''4/''' Construire une signature PROSITE à partir de votre alignement (n'utilisez pas le LOGO, sinon vous ne voyez pas précisément les zones de gap)
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     Pour vous aider, voici la début d'une signature (ou ''pattern'') : '''Q-L-x(3)-P-x(6)-[FY]-x(2)-V-x(3)-[LVF]-[FGD]-x(2,8)-[GPS]'''
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     Pour vous aider, voici le début d'une signature (ou ''pattern'') : '''Q-L-x(3)-P-x(6)-[FY]-x(2)-V-x(3)-[LVF]-[FGD]-x(2,8)-[GPS]'''
Vous avez probablement quelque chose d'approchant dans votre alignement, traduisant que :<br>
Vous avez probablement quelque chose d'approchant dans votre alignement, traduisant que :<br>
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[FY] : dans cette colonne seuls les acides aminés F ou Y sont présents <br>
[FY] : dans cette colonne seuls les acides aminés F ou Y sont présents <br>
x(2,8) : zone avec un gap. Entre 2 et 8 résidus (acides aminés) quelconques, suivant les séquences <br>
x(2,8) : zone avec un gap. Entre 2 et 8 résidus (acides aminés) quelconques, suivant les séquences <br>
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     Pour vous aider, voici la début d'une signature (ou ''pattern'') : '''Q-[IL]-H-x-T-[PQ]-x(2)-A x(3)-F'''
     Pour vous aider, voici la début d'une signature (ou ''pattern'') : '''Q-[IL]-H-x-T-[PQ]-x(2)-A x(3)-F'''
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[IL] : dans cette colonne seuls les acides aminés I ou L sont présents <br>
[IL] : dans cette colonne seuls les acides aminés I ou L sont présents <br>
x(2) : 2 colonnes avec des acides aminés variables <br>
x(2) : 2 colonnes avec des acides aminés variables <br>
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'''Pour rappel, regardez [http://snp.toulouse.inra.fr/~mathe/L3/TP4/signature2.pdf '''ici'''] les exemples du cours.'''
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'''Pour illustration, regardez [http://snp.toulouse.inra.fr/~mathe/L3/TP4/signature2.pdf '''ici'''] quelques exemples.'''
'''5/''' Tester votre signature sur [http://prosite.expasy.org/scanprosite/ '''ScanProsite'''] (choisir l'option 2) contre SwissProt ou trEMBL (plus long !) : les séquences obtenues appartiennent-elles à la famille des BCL2 ou BCL2-like ? Retrouvez-vous les mêmes organismes que précédemment ? en avez-vous d'autres ? <br>
'''5/''' Tester votre signature sur [http://prosite.expasy.org/scanprosite/ '''ScanProsite'''] (choisir l'option 2) contre SwissProt ou trEMBL (plus long !) : les séquences obtenues appartiennent-elles à la famille des BCL2 ou BCL2-like ? Retrouvez-vous les mêmes organismes que précédemment ? en avez-vous d'autres ? <br>
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[http://snp.toulouse.inra.fr/~mathe/L3/TP4/Blast.htm Résultats du Blast P]<br>
[http://snp.toulouse.inra.fr/~mathe/L3/TP4/Blast.htm Résultats du Blast P]<br>
[http://snp.toulouse.inra.fr/~mathe/L3/TP4/seq.fasta Jeu de Séquences]<br>
[http://snp.toulouse.inra.fr/~mathe/L3/TP4/seq.fasta Jeu de Séquences]<br>
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<!--MODIF CAUSE DISTANCIEL 2020
[http://snp.toulouse.inra.fr/~mathe/L3/TP4/ScanProsite_version_distanciel.html ScanProsite contre TrEMBL]<br>
[http://snp.toulouse.inra.fr/~mathe/L3/TP4/ScanProsite_version_distanciel.html ScanProsite contre TrEMBL]<br>
[http://snp.toulouse.inra.fr/~mathe/L3/TP4/phylo_tree_distanciel.png Arbre phylogénétique]<br>
[http://snp.toulouse.inra.fr/~mathe/L3/TP4/phylo_tree_distanciel.png Arbre phylogénétique]<br>
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<!--MODIF CAUSE DISTANCIEL 2020
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[http://snp.toulouse.inra.fr/~mathe/L3/TP4/ScanProsite.htm ScanProsite contre TrEMBL]<br>
[http://snp.toulouse.inra.fr/~mathe/L3/TP4/ScanProsite.htm ScanProsite contre TrEMBL]<br>
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[http://snp.toulouse.inra.fr/~mathe/L3/TP4/phylo_tree.png Arbre phylogénétique]<br>
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<!--ancienne version
[http://snp.toulouse.inra.fr/~mathe/L3/TP4/tree.JPG Arbre phylogénétique]<br>
[http://snp.toulouse.inra.fr/~mathe/L3/TP4/tree.JPG Arbre phylogénétique]<br>
-->
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Current revision as of 17:00, 25 November 2022


Contents

OBJECTIFS

   - Comprendre le résultat du programme BLAST
   - Utiliser un programme d'alignement multiple, et identifier des zones conservées, générer un Logo
   - Ecrire une signature protéique (pattern)
   - Rechercher dans une banque protéique des séquences qui possèdent cette signature 

Ci-dessous une sélection des sites Internet qui vous seront nécessaires :


Lors du TD3, vous avez étudié le gène BCL2 humain. Nous allons maintenant chercher des homologues à ce gène, construire un alignement multiple et une signature protéique.

Exercice 1 : recherche d'homologues avec BlastN

1/ A partir de la séquence de l'ARNm de l'isoforme alpha (NM_000633), lancer un BLASTN contre la banque nucleotide collection nr/nt (cochez la case Exclude models XM/XP)

2/ Regardez le résultat du BLAST et répondez aux questions suivantes :

  • pourquoi y a-t-il des lettres en minuscules dans le premier alignement ?
  • combien d'exons composent le gène ?
  • pourquoi la majorité des alignements sont sur la région 5' ?
  • existe-t-il le gène BCL2 chez le poulet ?

3/ Relancer un BLASTN en précisant l'organisme que vous cherchez, et avec 10 pour Expect threshold (seuil E-value) : quel est le résultat ?

4/ Des alignements avec des E-value >1 vous semblent-ils être de bons alignements ?

5/ Lancer un BLASTX toujours sur le même organisme et contre le banque nr : intérêt(s) de BLASTX ?

En fait, on travaillera plutôt au niveau protéique pour chercher des homologues, pour les raisons déjà vues au TP2 (conservation uniquement des CDS, pas sur les UTR, pas de problème de variation d'usage des codons donc taux d'identité plus élevé, et notion de similarité des acides aminés). Ici on connait la protéine donc mieux vaut faire un BLASTP qu'un BLASTX

Exercice 2 : recherche de protéines homologues à BCL2 humaine

1/ Récupérer la protéine codée par l'ARNm NM_000633, et utiliser maintenant BLASTP, contre la banque SwissProt

2/ Regardez l'alignement avec la séquence BCL2-like protein 1 de poulet Q07816

  • quelle est la taille de cette séquence ?
  • à quoi correspond le % positives ?
  • combien y a-t-il d'événement d'insertion-délétion ?

3/ Sélectionner les séquences qui vous semblent homologues à notre séquence (filtre avec alignement sur les 2/3 de la séquence query, et identité à plus de 30%)

4/ Récupérer les séquences en cliquant sur GenPept puis FASTA text.

5/ Copier les séquences dans un editeur de texte et renommer les pour avoir des noms courts : changer le nom dans l'entête FASTA, en gardant nom de protéine et de l'organisme, et sans espace (utilisez plutôt des 'tirets' _ ou -)

Vous pouvez garder le nom fourni dans SwissProt. Par exemple :

>sp|P10415.2|BCL2_HUMAN RecName: Full=Apoptosis regulator Bcl-2
devient :
>BCL2_HUMAN

Sauvegardez / Enregistrez votre fichier !

Exercice 3 : recherche d'homologues chez le nématode (Caenorhabditis)

Le nématode étant assez éloigné de l'homme il n'y avait probablement pas de séquences de nématode dans le résultat de BLASTP
Vous allez maintenant utiliser le programme PsiBLAST pour chercher des homologues chez cet organisme

1/ A partir de la protéine précédente, sélectionner la banque nr, préciser l'organisme Caenorhabditis et choisissez PsiBLAST dans la sélection des programmes de BLASTP.

2/ Sélectionner les séquences qui s'alignent sur la zone du domaine BCL2-like (cocher ou décocher les cases à droite) et lancer la 2e itération

3/ Observer les changements dans les résultats. Sélectionner les premières séquences, toujours alignées sur le domaine BCL2-like. Ne prenez pas les séquences de PDB (numéro d'accession commence par un chiffre). 1 séquence par organisme suffit !

4/ Rajouter ces quelques séquences à votre jeu de séquences précédent, en les renommant également.

Sauvegardez / Enregistrez votre fichier !

Exercice 4 : Alignement multiple et construction d'une signature protéique

1/ Sur le site de l'EBI utiliser MAFFT pour construire un alignement multiple (choisir Output format : ClustalW) : regarder l'alignement, et garder cette page ouverte !

2/ Visualiser l'alignement (onglet Result Viewers) soit avec Jalview (sur les PC, dans Programmes) soit avec Mview (en ligne) : regarder l'alignement. Jalview ou Mview sont juste des interfaces de visualisation. Où sont les parties conservées ? Voyez-vous apparaitre des groupes de séquences ?

3/ Copier le même alignement (Onglet Result Summary => fichier output) dans WebLogo : modifier le paramètre Logo range pour cibler la zone conservée (voir selon votre alignement) et Logo Size per Line : 40 x 5 cm

4/ Construire une signature PROSITE à partir de votre alignement (n'utilisez pas le LOGO, sinon vous ne voyez pas précisément les zones de gap)

   Pour vous aider, voici le début d'une signature (ou pattern) : Q-L-x(3)-P-x(6)-[FY]-x(2)-V-x(3)-[LVF]-[FGD]-x(2,8)-[GPS]

Vous avez probablement quelque chose d'approchant dans votre alignement, traduisant que :

Q-L : il n'y a que les acides aminés Q puis L dans 2 colonnes successives de l'alignement
x(3) : 3 colonnes avec des acides aminés variables
[FY] : dans cette colonne seuls les acides aminés F ou Y sont présents
x(2,8) : zone avec un gap. Entre 2 et 8 résidus (acides aminés) quelconques, suivant les séquences

Pour illustration, regardez ici quelques exemples.

5/ Tester votre signature sur ScanProsite (choisir l'option 2) contre SwissProt ou trEMBL (plus long !) : les séquences obtenues appartiennent-elles à la famille des BCL2 ou BCL2-like ? Retrouvez-vous les mêmes organismes que précédemment ? en avez-vous d'autres ?

6/ Regarder, par exemple dans le lien UniProt Q07816 (B2CL1_CHICK), comment est caractérisé ce domaine dans les banques : dans la partie Family and domain databases cliquez sur View potein in PROSITE : est-ce-que ce sont plutôt des signatures ou des profiles ?
On retiendra que les signatures (pattern en anglais) sont plutôt utilisées pour les motifs (régions assez courtes et bien conservées) et les profiles (matrices PSSM) pour des domaines protéiques

BONUS pour ceux qui ont encore du temps :
7/ Pour finir, vous pouvez générer un arbre phylogénétique de vos séquences : aller sur sur le site Phylogeny dans Phylogeny Analysis => "Advanced" : décocher la case Multiple alignment et celle Gblocks, et cliquer sur Create workflow. Coller votre alignement multiple. Vous pouvez aussi utiliser le mode "One click" et mettre directement les séquences non alignées en format Fasta (là aussi décocher Gblocks).
Essayer de comprendre l'histoire de cette famille et de voir les nœuds de spéciation et de duplication.

Annexes

Résultats du Blast P
Jeu de Séquences
ScanProsite contre TrEMBL
Arbre phylogénétique