Analyse de séquences I: recherche par similarité, alignements deux à deux
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Contexte Scientifique
Vous venez d'arriver dans une équipe de recherche travaillant sur le gène BCL2 humain, impliqué dans différents cancers. Une analyse fonctionnelle de BCL2 doit être réalisée chez la souris afin de mieux comprendre le rôle de la protéine codée par BCL2. Pour cela, il est nécessaire de disposer d'un anticorps dirigé contre un domaine de BCL2 et donc de produire ce domaine de manière hétérologue dans Escherichia coli, afin ensuite d'immuniser des lapins.
Ci-dessous une sélection des sites Internet qui vous seront nécessaires au cours des TD :
- Génopôle Toulouse
- EBI European Bioinformatics Institute (EMBL, GB)
- NCBI National Center for Biotechnology Information (NIH, USA)
- Expasy Expert Protein Analysis System (Swiss Institute of Bioinformatics, Suisse)
- PBIL Pôle Bio-Informatique Lyonnais (CNRS, Lyon)
- Institut Pasteur
Recherche dans les banques
Dans un premier temps, il est nécessaire de récupérer les séquences humaines codées par BCL2.
- Sur le site du NCBI, recherchez les protéines codées par le gène BCL2.
- Combien en avez-vous ? Sélectionnez celles qui proviennent du génome humain.
- Vérifier que ceux sont toutes des protéines codées par BCL2 et non des protéines associées à BCL2. Pour cela, parcourez quelques entrées et l'endroit dans la fiche où le nom BCL2 apparaît.
- Affinez votre requête en utilisant Advanced search et en spécifiant les champs des fiches ou la requête doit être effectuée, ceci afin d'identifier que les protéines humaines codées par le gène BCL2. Remarque : le bouton Preview permet de vérifier combien de fiches seront retournées par la requête.
- Restreindre la recherche à la banque RefSeq (utiliser l'onglet limits).
- Vous devriez maintenant avoir 2 isoformes NP_000624 et NP_000648.
- Comparer les séquences deux à deux, en utilisant une matrice de point (dotplot). Les logiciels sont disponibles dans la suite EMBOSS.
- Utiliser DOTPATH qui permet de dessiner un dotplot avec une taille de mot fixée.
- Que pouvez-vous conclure ?
Analyse d'une séquence protéique
Afin d'appréhender l'organisation structurale et la localisation cellulaire de BCL2, une analyse fine des séquences protéiques est nécessaire.
- Allez sur le site d'Expasy. Qu'est-ce que le serveur Expasy ?
- Parcourez les outils mis à votre disposition, soit dans le menu Tools, soit à partir de la liste complète accessible depuis le lien full list dans la section Tools and Software de la page d'accueil.
- Etudiez maintenant la plus longue des deux séquences trouvées précédemment.
- Trouvez un ou des programmes pour calculer le poids moléculaire et le point isoélectrique de la protéine.
- Utilisez ScanProsite, InterPro Scan (lien vers l'EBI) ou SMART (lien vers SMART) pour chercher si elle contient des domaines connus. Analysez les domaines identifiés et notez leur position.
- Avec le programme TopPred (cochez la case pour obtenir une image), recherchez si la protéine contient des domaines membranaires.
- Effectuer une prédiction de structures secondaires avec le programme GOR.
- Synthétisez les différentes informations et résultats que vous avez obtenus et comparez-les avec les annotations présentes dans la fiche de la séquence.
- A ce stade, vous avez sûrement remarqué sur la fiche de NP_000624 la mention de l'entrée P10415 d'UniProt/SwissProt. Retournez sur le site de l'Expasy pour consulter la fiche de cette protéine.
- Parcourez la section General annotation (Comments) ; celle-ci correspond à l'annotation ajoutée par les experts.
- Comparez ces annotations à celles trouvées dans la section suivante Gene Ontology, par exemple en ce qui concerne sa fonction. Suivre une des références croisées vers GO (par exemple anti-apoptosis) pour apprécier la structure hiérarchique de ce vocabulaire.
- Intéressez vous ensuite à la partie Sequence annotation (Features) et comparez les annotations à vos propres études menées précédemment.
Synthèse d'amorces PCR
Suite à l'analyse in silico de vos séquences, on souhaite cloner le transcrit codant NP_000624 (P10415) dans un vecteur d'expression d' E. coli. Le laboratoire dispose actuellement du transcrit cloné dans un vecteur non adapté pour l'expression dans E. coli, il faut donc amplifier ce transcrit par PCR, puis réaliser différentes étapes pour cloner l'insert dans le vecteur d'expression d'E. coli.
- Décrivez succintement les étapes de clonage a réaliser, pour obtenir le vecteur d'expression d'E. coli
- Identifiez en utilisant les bases de données le transcrit de NP_000624 (P10415).
- Quel est son numéro d'accession dans les banques de données ?
- En regardant les positions des motifs que vous avez trouvés, quelles parties de la séquence n'appartient pas à un domaine ?
- Identifiez des primers (oligonucléotides) pouvant amplifier l'ensemble du transcrit codant pour NP_000624, en utilisant le logiciel Primer-Blast disponible sur la GenBank.
NB: a partir de la fiche EMBL du transcrit, vous pouvez accéder directement a Primer-Blast en cliquant sur 'Pick Primers' (colonne de droite).
Recherche d'ORF
Afin de vérifier que le vecteur d'expression obtenu est correct et contient l'insert d'interêt, le resultat du séquençage du clone est fourni dans le fichier joint ici. Vous allez vérifier que ce clone code pour la protéine attendue. Pour cela, vous allez déterminer l'ORF et la position de la séquence codante la plus probable en recherchant les cadres de lecture présents.
- Sur EMBOSS, dans la rubrique Nucleic translation, utilisez sixpack en spécifiant le paramètre ORF start with M à Yes.
- Regarder les traductions dans les différents cadres de lecture.
- Quelle ORF pourrait contenir la séquence codante ? Pourquoi ?
- Utilisez maintenant le programme ORF Finder au NCBI pour effectuer la recherche de séquence codante. Interprétez le graphique et les résultats obtenus.
- Afin de valider votre hypothèse quant à l'ORF la plus probable, il est necessaire d'aller identifier dans les banques de données si cette ORF code pour la protéine Bcl2. Pour cela vous allez réaliser un Blastp
- Dans ORF Finder, utilisez l'option Blastp sur la banque nr. Que concluez-vous ?
- Identifiez l'ORF codante.
Analyse de la famille protéique
Recherche dans les banques par similitude de séquences
Utiliser votre protéine (P10415) comme sonde pour une recherche avec le logiciel BlastP sur le site du NCBI, en choisissant soit la banque nr, soit la banque SwissProt. Différence entre les deux résultats?
Les résultats du programme Blast vous ont montré que votre séquence appartenait à une famille bien représentée dans les banques de données. Vous disposez donc d'un ensemble de séquences qui vont vous permettre de faire une analyse plus approfondie, notamment de rechercher la présence de régions conservées dans ces séquences, qui pourront être des sites privilégiés pour des expériences de mutagénèse. Pour cela, on réalisera un alignement multiple des séquences.
Alignement multiple
A partir des résultats obtenus à l'exercice précédent avec la banque SwissProt, sélectionner un ensemble de séquences pour réaliser l'alignement multiple (une dizaine). Attention, si vous voulez faire ressortir des zones conservées versus des zones peu ou pas conservées au cours de l'évolution, il faut construire un échantillon dans lequel vous prendrez en compte des séquences proches mais aussi des séquences éloignées. Ne pas oublier d'inclure la protéine d'intérêt. Les séquences doivent être extraites au format FASTA. Pour cela, dans la page de réponse de BlastP, cocher les séquences que vous voulez conserver puis à la fin de la page, cliquer sur Get selected sequences. Dans la nouvelle page, choisir dans le menu Display FASTA et dans le menu Send to Text ou Send to File. Sauvegarder les séquences dans un fichier texte. Réaliser l'alignement multiple en utilisant le programme ClustalW sur le serveur PBIL. Sauvegarder cet alignement sur votre disque (sur la page de réponse, aller à Result files (text), cliquer sur le lien CLUSTALW, sauvegarder la page). Analyser l'alignement en repérant notamment les régions conservées.
L'étape suivante consiste à essayer de trouver une explication fonctionnelle et/ou structurale à ces régions conservées.
La banque de données PROSITE renferme les signatures protéiques qui ont été établies pour différentes familles de protéines à partir d'alignements multiples dans lesquels les zones conservées ont été repérées. Cette conservation peut être représentée sous forme de motifs consensus ou sous forme de profils matriciels. Ces motifs sont ensuite recherchés dans l'ensemble des séquences, et s'ils ne sont trouvés que dans les séquences appartenant à la famille étudiée, ils sont considérés comme caractéristiques (spécifiques) de cette famille et constituent une signature protéique. Certains motifs peuvent être associés à une fonction (site catalytique, site de liaison à un ion, etc).
Est-ce que les zones que vous avez repérées correspondent aux motifs et domaines identifiés en tout début d'analyse (section Analyse d'une séquence protéique, partie ScanProsite et InterPro Scan) ?
Recherche de motifs et de domaines dans les séquences
A partir de l'alignement multiple, établir un motif PROSITE correspondant à une zone conservée que vous espérez spécifique de la famille. Exemple d'un motif PROSITE : G-A-[ILV]-X-D. Dans les cas où l'acide aminé est strictement conservé dans toutes les séquences alignées, on fait figurer son code à une lettre. C'est le cas ici des acides aminés G,A et D. Quand à une même position de l'alignement, on observe plusieurs acides aminés, on les énumère entre crochets ([ILV]). Si le nombre d'acides aminés différents est trop important, on remplace cette énumération par X qui veut dire n'importe quel acide aminé. Quand on recherchera ce motif dans une séquence, on retiendra comme occurrences GAIMD, GAIRD, GALMD, GAVKD, etc.
Quand vous avez établi votre motif, rechercher sa présence dans les séquences de SwissProt et TrEMBL (logiciel ScanProsite). D'après les résultats obtenus, pensez-vous qu'il est spécifique aux séquences de la famille à laquelle appartient votre protéine ?
