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Revision as of 14:17, 8 March 2011

Banques et manipulations de séquences

Ci-dessous une sélection des sites Internet qui vous seront nécessaires au cours des TD :

• Génopôle Toulouse
• EBI European Bioinformatics Institute (EMBL, GB)
• NCBI National Center for Biotechnology Information (NIH, USA)
• Expasy Expert Protein Analysis System (Swiss Institute of Bioinformatics, Suisse)
• PBIL Pôle Bio-Informatique Lyonnais (CNRS, Lyon)
• Institut Pasteur

Contexte scientifique : vous venez d'arriver dans une équipe de recherche travaillant sur le gène BCL2 humain, impliqué dans différents cancers. Une analyse fonctionnelle de BCL2 doit être réalisée chez la souris afin de mieux comprendre le rôle de la protéine codée par BCL2. Pour cela, il est nécessaire de disposer d'un anticoprs dirigé contre un domaine de BCL2 et donc de produire ce domaine de manière hétérologue dans Escherichia coli, afin ensuite d'immuniser des lapins.

Recherche dans les banques

Dans un premier temps, il est nécessaire de récupérer les séquences humaines codées par BCL2.

• Sur le site du NCBI, recherchez les protéines codées par le gène BCL2.

Combien en avez-vous ? Sélectionnez celles qui proviennent du génome humain.

Vérifier que ceux sont toutes des protéines codées par BCL2 et non des protéines associées à BCL2. Pour cela, parcourez quelques entrées et l'endroit dans la fiche où le nom BCL2 apparaît.

La page de recherche avancée (Advanced search) permet d'affiner votre requête. Exploiter au mieux les critères de recherche à votre disposition en utilisant la recherche dans certains champs des fiches pour ne rechercher que les protéines humaines codées par le gène BCL2. Remarque : le bouton Preview permet de vérifier combien de fiches seront retournées par la requête.

• Restreindre la recherche à la banque RefSeq (utiliser l'onglet limits).

Vous devriez maintenant avoir 2 isoformes NP_000624 et NP_000648.

• A l'aide des programmes de comparaison et d'alignement de séquences de la suite EMBOSS, comparez les séquences protéiques des 2 isoformes. Quelles sont vos conclusions ?

Analyse d'une séquence protéique

Afin d'appréhender l'organisation structurale et la localisation cellulaire de BCL2, une analyse fine des séquences protéiques est nécessaire.

• Allez sur le site d'Expasy. Qu'est-ce que le serveur Expasy ?

Parcourez les outils mis à votre disposition, soit dans le menu Tools, soit à partir de la liste complète accessible depuis le lien full list dans la section Tools and Software de la page d'accueil.

• Etudiez maintenant la plus longue des deux séquences trouvées précédemment.

Trouvez un ou des programmes pour calculer le poids moléculaire et le point isoélectrique de la protéine.

Utilisez ScanProsite, InterPro Scan (lien vers l'EBI) ou SMART (lien vers SMART) pour chercher si elle contient des domaines connus. Analysez les domaines identifiés et notez leur position.

Avec le programme TopPred (cochez la case pour obtenir une image), recherchez si la protéine contient des domaines membranaires.

Effectuer une prédiction de structures secondaires avec le programme GOR.

• Synthétisez les différentes informations et résultats que vous avez obtenus et comparez-les avec les annotations présentes dans la fiche de la séquence.

• A ce stade, vous avez sûrement remarqué sur la fiche de NP_000624 la mention de l'entrée P10415 d'UniProt/SwissProt. Retournez sur le site de l'Expasy pour consulter la fiche de cette protéine.

Parcourez la section General annotation (Comments) ; celle-ci correspond à l'annotation ajoutée par les experts.

Comparez ces annotations à celles trouvées dans la section suivante Gene Ontology, par exemple en ce qui concerne sa fonction. Quelle mesure de qualité est associée aux annotations GO ? Suivre une des références croisées vers GO (par exemple anti-apoptosis) pour apprécier la structure hiérarchique de ce vocabulaire.

Intéressez vous ensuite à la partie Sequence annotation (Features) et comparez les annotations à vos propres études menées précédemment.

Synthèse d'une sonde spécifique pour hybrider une banque d'ADNc

Suite à l'analyse in silico de vos séquences, il est nécessaire de récupérer dans une banque d'ADNc humaine disponible au laboratoire, les clones correspondant à l'ADNc de BCL2.

• En regardant les positions des motifs que vous avez trouvés, quelles parties de la séquences n'appartiennent pas à un domaine ?

Les domaines protéiques peuvent être partagés par d'autres protéines. Les régions spécifiques sont donc plus probablement en dehors des domaines. Parmi ces régions, laquelle n'est pas commune à l'isoforme de cette protéine ?

• Utilisez le programme extractseq de la suite EMBOSS pour extraire la région identifiée.

Toujours avec EMBOSS, dans la rubrique Nucleic translation, utilisez le programme backtranseq pour faire la traduction inverse (génération de l'ARNm le plus probable, à partir de la séquence protéique, en fonction de l'usage des codons propre à l'organisme sélectionné).

• Vérifiez via un alignement (suite EMBOSS) avec la séquence du gène BCL2 (GenBank), si la sonde générée permettrait de récupérer le cDNA codant pour BCL2

 par hybridation de la banque ADNc.

• En fait, on dispose de la séquence du gène BCL2, donc il est préférable d'utiliser cette séquence plutôt que le résultat de backtranseq. Retournez sur le site du NCBI pour retrouvez la séquence du gène BCL2, et notamment extraire (utiliser extractseq) la région correspondant à la séquence codante extraite précédemment.

Recherche d'ORF

Afin de vérifier le clone obtenu suite au criblage de la banque d'ADNc, un séquençage est réalisé et la séquence obtenue est disponible ici. Vous allez vérifier que cet ADNc code pour la protéine attendue. Pour cela, vous allez déterminer l'ORF et la position de la séquence codante la plus probable de l'ADNc en recherchant les cadres de lecture présents.

• Sur EMBOSS, dans la rubrique Nucleic translation, utilisez sixpack en spécifiant le paramètre ORF start with M à Yes.

Regarder les traductions dans les différents cadres de lecture.

Quelle ORF vous pourrait contenir la séquence codante ? Pourquoi ?

• Utilisez maintenant le programme ORF Finder au NCBI pour effectuer la recherche de séquence codante. Interprétez le graphique et les résultats obtenus.

Avec l'option blastp sur la banque nr, disponible dans ORF Finder, identifiez l'ORF contenant la séquence codante.