TD2 Genome Selection Plantes

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		+	'''
	==Objectifs==		==Objectifs==
-	Ce TD a pour but d'apprendre a comparer des séquences deux a deux via différentes methodes (matrice de point, alignement global et local)	+	Ce TD a pour but de vous familiariser avec les méthodes de comparaison de séquences biologiques, la recherche de séquences similaires (BLAST), la recherche d'ORF dans une séquence et de mettre en application votre savoir-faire.
-	== Exercice 1 : Comparaison de 2 séquences avec une matrice de point (dot plot) ==	+	Quelques liens utiles:
		+	*[https://www.ncbi.nlm.nih.gov/ NCBI]
-	* Rechercher les 2 séquences enregistrées sous les numéros d'accession P10415 et Q64373	+	*[http://www.ebi.ac.uk/ EBI - European Bioinformatics Institute]
-	* Que pouvez vous dire sur ces 2 séquences ?	+
-	* Comparer les séquences deux à deux, en utilisant une matrice de point (dotplot).	+
-	Les logiciels sont disponibles dans la suite [http://vm-bioinfo.toulouse.inra.fr/emboss/ EMBOSS].	+
-	:Utiliser '''DOTPATH''' qui permet de dessiner un '''dotplot''' avec une taille de mot fixée.	+
-	:Que pouvez-vous conclure ?	+
-	== Exercice 2: Comparaison de 2 séquences par alignement global et local ==	+	==Contexte==
-	Nous allons continuer la comparaison entre nos 2 séquences en utilisant des méthodologies d'alignement permettant d'évaluer la significativité de l'alignement	+	Nous resterons dans le contexte scientifique du précédent TD s'intéressant aux chitinases afin de définir si ces enzymes pourraient avoir un intérêt dans des approches de biotechnologie végétale.
		+	On s'intéressera ici à identifier une séquence nucléique de chitinase afin de l'introgresser dans un génome végétal sous contrôle de séquences régulatrices adaptées et d'évaluer si cette approche pourrait permettre de favoriser la protection des plantes lors d'une infection microbienne.
-	* Faites un alignement '''global''' (de bout à bout) entre les 2 séquences avec '''Needle''' disponible sur EMBOSS	+	== Exercice 1 : Recherche d'ORF sur un ARNm ==
-	:Qu'observez vous ?	+
-	:Combien y a-t-il de gaps ? A quoi correspondent-ils ?<br/>	+
-	:A quoi correspond le pourcentage de similarité ? <br/>	+
-	:Quels sont les paramètres de calcul du score ? <br/>	+
-	:Votre alignement est-il significatif ?	+
-	* Faites un alignement local avec '''Matcher''' disponible sur EMBOSS	+	Le criblage d'une banque d'ADNc de l'oomycète a permis très probablement d'identifier la séquence nucléique correspondant à la protéine 'chitinase GH19' travaillée au cours du précédent TD. Il faut maintenant de vérifier si cette séquence code effectivement pour la protéine 'chitinase-GH19' afin de pouvoir l'insérer sous contrôle de séquences régulatrices adaptées au sein d'une plante d'intérêt.
-	:Qu'observez-vous ? <br/>	+
-	:Demandez à voir d'autres alignements.<br/>	+
-	:Sont-ils significatifs ?	+
-	== Exercice 3 : Comparaison de plusieurs séquences par alignement multiple ==	+	La séquence obtenue après criblage de la banque d'ADNc est disponible ci-dessous
		+	<br><br>
		+	>Oom_cDNA
-	L'idée maintenant est de comparer plusieurs séquences similaires entre elles, afin par exemple d'en définir les liens évolutifs.	+	ACAACATATCCAGTCACTATGGGGCCCGTCGACCTGCAGACTGGCTGTGTATAAGGGAGC
		+	CTGACATTTATATTCCCCAGAACATCAGGTTAATGGCGTTTTTGATGTCATTTTCGCGGT
		+	GGCTGAGATCAGCCACTTCTTCCCCGATAACGGAGACCGGCACACTGGCCATATCGGTGG
		+	TCATCATGCGCCAGCTTTCATCCCCGATATGCACCACCGGGTAAAGTTCACGCAAGCAAG
		+	CAGCCAAATCAGCCTATCAACCCAAGTCAGCCATGAAATTCGTCGGGGTTATCGCGTCAA
		+	GTCTTCTGGTTGTGCCTTCTGCGGTCTCTGGTGACGCTGATAGCTCGAGTTTCGCTCGCT
		+	TCTTCGATCAGGATCGTTTCCAGGAGGTTTTCCCGGACGCTGTGGAGCTCTACAACTTCA
		+	ACGGTCTTGTGGATGCGGCCAGCAAGTACAGCGAATTCGCTAATACGGGCAACGACGACA
		+	ATGACAAGCGTGAGCTGGCAGCGTTCCTGGCTCAAACAGCTCACGAGTGCGACAGCTTCA
		+	AGGCCGCGGAAGAGTACGCCCGTGACACCTACTCGGTGTGGCAGTACTGCGACAACGCCA
		+	CCTACACGTGTGCCCCCGGTCGCCGTTACCACGGCCGTGGCCCCATTCAGCTCTCATGGA
		+	ACTACAATTACTACAATGCTGGCGAAGCTCTGGGCATTGATCTCTTAAACAACCCGGACA
		+	TCGTCGCGACAGACACGACGGTGACGTGGATGACTGCGCTTTGGTACTGGATGACTCCGC
		+	ATGGCGGCCGTGTGATCCACGACATCGTCGCCGGTGAGAACGGATTCGCTCAATCCACCG
		+	ATATCATCAACGGTGGTCTGGAGTGCGGTCCGGACGCTCCCAACACGTCGAACGAGCAAC
		+	AACGTATCACGTACTTCACCAAGATGTGCGAGGCTCTGGGCGTGGAGCCTCTGGGCGCCA
		+	CCTCGTGCAACGCCTAGAGTGGGTATGCATCAAAACAAGTTTTACAAAGTAGTGAATAAG
		+	CAAAAAAGACTTTGCTTGTATTTGTGGCAGCTCCCCTTAAACGCCAGCTTTCATCCCCGA
		+	TATGCACCACCGGGTAAAGTTCACGAAGGGCGAGGAGGATAACATGGCCATCATCAAGGA
		+	GTTCATGCGCTTCAAGGTGCACATGGAGGGCTCCGTGAACGGCCACGAGTTCGAGATCGA
		+	GGGCGAGGGCGAGGGCCGCCCCTACGAGGGCACCCAGACCGCCAAGCTGAAGGTGACCAA
		+	GGGTGGCCCCCTGCCCTTCGCCTGGGACATCCTGTCCCCTCAGTTCATGTACGGCTCCAA
		+	GGCCTACGTGAAGCACCCCGCCGACATCCCCGACTACTTGAAGCTGTCCTTCCCCGAGGG
		+	CTTCAAGTGGGAGCGCGTGATGAACTTCGAGGACGGCGGCGTGGTGACCGTGACCCAGGA
		+	CTCCTCCCTGCAGGACGGCGAGTTCATCTACAAGGTGAAGCTGCGCGGCACCAACTTCCC
		+	CTCCGACGGCCCCGTAATGCAGAAGAAGACTATGGGCTGGGAGGCCTCCTCCGAGCGGAT
		+	GTACCCCGAGGACGGCGCCCTGAAGGGCGAGATCAAGCAGAGGCTGAAGCTGAAGGACGG
		+	CGGCCACTACGACGCTGAGGTCAAGACCACCTACAAGGCCAAGAAGCCCGTGCAGCTGCC
		+	CGGCGCCTACAACGTCAACATCAAGTTGGACATCACCTCCCACAACGAGGACTACACCAT
		+	CGTGGAACAGTACGAACGCGCCGAGGGCCGCCACTCCACCGGCGGCATGGACGAGCTGTA
		+	CAAGTAA
-	* Réalisez un Blast avec P10415 sur la banque SwissProt
-	* Sélectionner un ensemble de séquences pour réaliser l'alignement multiple (une dizaine).	+	<br>
-	'''''ATTENTION:''' si vous voulez faire ressortir des zones conservées versus des zones peu ou pas conservées au cours de l'évolution, il faut construire un échantillon dans lequel vous prendrez en compte des séquences proches mais aussi des séquences éloignées.	+	Afin d'identifier si cette séquence a une similitude avec des séquences déjà répertoriées, nous allons utiliser l'outil BLAST (Basic Local Alignement Search Tool) sur le site du [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ NCBI] (colonne de droite :Popular resources => BLAST => Nucleotide BLAST)
-	''Ne pas oublier  d'inclure la protéine d'intérêt P10415''	+	<br>
		+	''!! Avant de lancer votre BLAST, choisissez l'option 'somewhat similar # MEGABLAST (bas de page du BLASTn)'
	''		''
		+	<br>
		+	* La séquence d'ADNc obtenue est -elle similaire à des séquences référencées dans les banques de données ?
		+	* A partir de quel organisme a donc été réalisé la banque d'ADNc?
		+	* Quel est le numéro d'accession de la séquence protéique codée par la séquence ayant une similarité avec votre ADNc ?
-	Les séquences doivent être extraites au format FASTA. Pour cela, dans la page de réponse de BlastP, cocher les séquences que vous voulez conserver puis à la fin de la page, cliquer sur ''Get selected sequences''. Dans la nouvelle page, choisir dans le menu ''Display FASTA (text)''. Sauvegarder les séquences dans un fichier texte. <br/>	+	<!--
		+	Sortie du blastN
		+	Phytophthora infestans clone MY-17-E-12 acidic chitinase mRNA, complete cds Phytophthora infestans 1496 1496 45% 0.0 100.00% 858 AF424684.1 codant pour AAN31509  234 aa
		+	-->
-	*Sur le site de l'EBI utiliser [http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/mafft/ '''MAFFT'''] pour construire un alignement multiple (dans Services => Proteins => MAFFT, choisir Output format : Clustal) : regarder l'alignement, et garder cette page ouverte ! <br>
-	* Visualiser l'alignement soit avec Jalview (dans Result summary) soit avec Mview (toujours à l'EBI) : regarder l'alignement. Où sont les parties conservées ? Voyez-vous apparaitre des groupes de séquences ?	+	<br>
		+	Maintenant que vous avez vérifié la qualité et nature de votre séquence ADNc, il est nécessaire d'identifier le cadre de lecture ouvert (ORF). Pour cela, nous allons prédire les différentes ORF possible sur votre séquence en travaillant sur les différents cadre de lecture.
-	*Copier le même alignement dans [http://weblogo.berkeley.edu/logo.cgi/ '''WebLogo'''] : modifier le paramètre '''Logo range''' pour cibler la zone conservée (voir selon votre alignement) et ''Logo Size per Line'' : 40 x 5 cm <br>	+	Pour cela nous allons utiliser l'outil '''ORFfinder''' disponible au au [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ NCBI]. (colonne de gauche > Resources List > Classement par ordre alpahabétique)
-	*Construire une signature PROSITE à partir de votre alignement (n'utilisez pas le LOGO, sinon vous ne voyez pas précisément les zones de gap)	+	<br>
-	Pour vous aider, voici la début d'une signature (ou ''pattern'') : '''Q-L-x(3)-P-x(6)-[FY]-x(2)-V-x(3)-[LVF]-[FGD]-x(2,8)-[GPS]'''	+	''Dans les paramètres d'ORFfinder, indiquer 300nt comme taille minimale des ORFs (=100 acide aminés).
-	Vous avez probablement quelque chose d'approchant dans votre alignement, traduisant que :<br>	+	* Interprétez le graphique obtenu
		+	* Quelle ORF vous paraît être la plus probable ? Pourquoi ?
		+	* Comment pouvez-vous le vérifier ?
		+	* Utilisez dans ORF Finder, l'option '''BLASTp''' contre la banque de données 'nr (non redundant protein sequences)' et identifiez si l'ORF sélectionnée est la plus probable.
		+	Notez la position de l'ORF (taille, codon start, codon stop, taille attendue de la protéine)''
-	Q-L : il n'y a que les acides aminés Q puis L dans 2 colonnes successives de l'alignement <br>
-	x(3) : 3 colonnes avec des acides aminés variables <br>
-	[FY] : dans cette colonne seuls les acides aminés F ou Y sont présents <br>
-	x(2,8) : zone avec un gap. Entre 2 et 8 résidus (acides aminés) quelconques, suivant les séquences <br>
-	'''5/''' Tester votre signature sur [http://prosite.expasy.org/scanprosite/ '''ScanProsite'''] (choisir l'option 2) contre SwissProt ou trEMBL (plus long !) : les séquences obtenues appartiennent-elles à la famille des BCL2 ou BCL2-like ? Retrouvez-vous les mêmes organismes que précédemment ? en avez-vous d'autres ? <br>
-	'''6/''' Regarder, par exemple dans le premier lien UniProt, comment est caractérisé ce domaine dans les banques : ouvrez le '''Graphical view''' de Prosite : est-ce-que ce sont plutôt des signatures ou des profiles ? <br>	+	<!--
		+	SeOqom = cloning GW vector::sequencechitinase::GFP ORF, donc dans ORF finder ORF1= GFP ORF2= chitinase
		+	ORF1 + 2 1082 1807 726 | 241
		+	ORF2 + 3 273 977 705 | 234
-	* Réaliser l'alignement multiple en utilisant le programme '''Clustal''' (Clustal Omega) sur le serveur d'Expasy [http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/ d'Expasy ]. Sauvegarder cet alignement sur votre disque (sur la page de réponse, aller à Result files (text), cliquer sur le lien CLUSTALW, sauvegarder la page).	+
-	Analyser l'alignement en repérant notamment les régions conservées.	+	>tr|Q8H6Y7|Q8H6Y7_PHYIN Acidic chitinase OS=Phytophthora infestans OX=4787 PE=2 SV=1
		+	MKFVGVIASSLLVVPSAVSGDADSSSFARFFDQDRFQEVFPDAVELYNFNGLVDAASKYS
		+	EFANTGNDDNDKRELAAFLAQTAHECDSFKAAEEYARDTYSVWQYCDNATYTCAPGRRYH
		+	GRGPIQLSWNYNYYNAGEALGIDLLNNPDIVATDTTVTWMTALWYWMTPHGGRVIHDIVA
		+	GENGFAQSTDIINGGLECGPDAPNTSNEQQRITYFTKMCEALGVEPLGATSCNA
		+
		+	>AF424684.1 Phytophthora infestans clone MY-17-E-12 acidic chitinase mRNA, complete cds
		+	CAAGCAAGCAGCCAAATCAGCCTATCAACCCAAGTCAGCCATGAAATTCGTCGGGGTTATCGCGTCAAGT
		+	CTTCTGGTTGTGCCTTCTGCGGTCTCTGGTGACGCTGATAGCTCGAGTTTCGCTCGCTTCTTCGATCAGG
		+	ATCGTTTCCAGGAGGTTTTCCCGGACGCTGTGGAGCTCTACAACTTCAACGGTCTTGTGGATGCGGCCAG
		+	CAAGTACAGCGAATTCGCTAATACGGGCAACGACGACAATGACAAGCGTGAGCTGGCAGCGTTCCTGGCT
		+	CAAACAGCTCACGAGTGCGACAGCTTCAAGGCCGCGGAAGAGTACGCCCGTGACACCTACTCGGTGTGGC
		+	AGTACTGCGACAACGCCACCTACACGTGTGCCCCCGGTCGCCGTTACCACGGCCGTGGCCCCATTCAGCT
		+	CTCATGGAACTACAATTACTACAATGCTGGCGAAGCTCTGGGCATTGATCTCTTAAACAACCCGGACATC
		+	GTCGCGACAGACACGACGGTGACGTGGATGACTGCGCTTTGGTACTGGATGACTCCGCATGGCGGCCGTG
		+	TGATCCACGACATCGTCGCCGGTGAGAACGGATTCGCTCAATCCACCGATATCATCAACGGTGGTCTGGA
		+	GTGCGGTCCGGACGCTCCCAACACGTCGAACGAGCAACAACGTATCACGTACTTCACCAAGATGTGCGAG
		+	GCTCTGGGCGTGGAGCCTCTGGGCGCCACCTCGTGCAACGCCTAGAGTGGGTATGCATCAAAACAAGTTT
		+	TACAAAGTAGTGAATAAGCAAAAAAGACTTTGCTTGTATTTGTGGCAGCTCCCCTTAAAAAAAAAAAAAA
		+	AAAAAAAAAAAAAAAAAA
		+
		+
		+	-->
		+
		+	== Exercice 2 : Définition d'amorces PCR ==
		+
		+	Vos analyses précédentes indiquent que votre séquence est correcte, il faut maintenant amplifier la phase ouverte de lecture (ORF) afin de l'insérer dans un vecteur sous contrôle de séquences régulatrices qui permettront son expression après transformation des plantes d'intérêt.
		+
		+	Il faut donc définir des amorces pour faire une PCR.
		+
		+
		+	A partir de votre séquence d'ADNc, faites une recherche d’amorces PCR avec le programme '''Primer3''' disponible [https://primer3.ut.ee/ ici]. <br>
		+	<br>
		+	* Quel est le cahier des charges par défaut de la définition d'amorces PCR avec Primer 3 ?
		+	* Obtenez vous un couple d'amorces (primers) PCR dans la zone d'intérêt ?
		+	* Pouvez-vous identifiez un couple de primers avec un Tm=55°C comme optimal (min 52, max 60) dans votre zone d'intéret ?
		+
		+	<br>
		+	Vous disposez au laboratoire du couple d'amorces ci-dessous, est-il adapté à votre expérience ?
		+
		+	sens :    AATCAGCCTATCAACCCAAG <br/>
		+	reverse:  TGTTTTGATGCATACCCACT <br/>
		+
		+	<!--
		+	Le couple de primers ne fonctionne qu'avec Tm=55°C comme optimal (min 52, max 60)
		+
		+	''Paramétrez le programme pour sélectionner au mieux la zone que vous voulez amplifier (= '''la phase ouverte de lecture''') en conservant les paramètres par défaut du logiciel <br>
		+	''Il faudra définir la zone que vous voulez amplifier dans Targets. Le programme demande : ''position_début'', ''longueur_de_la_zone''.<br>
		+	''Exemple: Targets : 40,180 <=> on veut amplifier depuis la position 40 jusqu'à la position 220 (40+180)''''''
		+	-->
		+
		+	== Exercice 3 : Analyses des plantes exprimant la construction  ==
		+
		+	Trois plantes génétiquement modifiées et possédant la construction précédente ont été obtenues (Trans1, Trans2 et Trans3).
		+	Il faut maintenant évaluer si la construction 'chitinase' présente un avantage pour la plante. <br>
		+	Deux expériences ont été réalisés avec avec le champignon phytopathogène ''Fusarium solani'' et le champignon opportuniste ''Candida albicans''.
		+
		+	Les résultats des différentes expériences sont présentés  [[File:ResultsCHN2.jpg|800px|]]
		+
		+	* Quel était l'objectif de l'expérience de la figure 1 ?
		+	* Interprétez la figure 1
		+	* Quel contrôle est manquant dans la Figure 1 ?
		+	* Comment pouvez-vous expliquez les résultats obtenus ?
		+
		+	* Quelle hypothèse a conduit à mener l'expérience de la figure 2 ?
		+	* Interprétez la figure 2
		+
		+	** Conclure quant à l'intérêt des CHN dans des applications de biotechnologie végétale

---

Current revision as of 19:25, 7 December 2022

Contents 1 Objectifs 2 Contexte 3 Exercice 1 : Recherche d'ORF sur un ARNm 4 Exercice 2 : Définition d'amorces PCR 5 Exercice 3 : Analyses des plantes exprimant la construction

Objectifs

Ce TD a pour but de vous familiariser avec les méthodes de comparaison de séquences biologiques, la recherche de séquences similaires (BLAST), la recherche d'ORF dans une séquence et de mettre en application votre savoir-faire.

Quelques liens utiles:

• NCBI

• EBI - European Bioinformatics Institute

Contexte

Nous resterons dans le contexte scientifique du précédent TD s'intéressant aux chitinases afin de définir si ces enzymes pourraient avoir un intérêt dans des approches de biotechnologie végétale. On s'intéressera ici à identifier une séquence nucléique de chitinase afin de l'introgresser dans un génome végétal sous contrôle de séquences régulatrices adaptées et d'évaluer si cette approche pourrait permettre de favoriser la protection des plantes lors d'une infection microbienne.

Exercice 1 : Recherche d'ORF sur un ARNm

Le criblage d'une banque d'ADNc de l'oomycète a permis très probablement d'identifier la séquence nucléique correspondant à la protéine 'chitinase GH19' travaillée au cours du précédent TD. Il faut maintenant de vérifier si cette séquence code effectivement pour la protéine 'chitinase-GH19' afin de pouvoir l'insérer sous contrôle de séquences régulatrices adaptées au sein d'une plante d'intérêt.

La séquence obtenue après criblage de la banque d'ADNc est disponible ci-dessous

>Oom_cDNA

ACAACATATCCAGTCACTATGGGGCCCGTCGACCTGCAGACTGGCTGTGTATAAGGGAGC CTGACATTTATATTCCCCAGAACATCAGGTTAATGGCGTTTTTGATGTCATTTTCGCGGT GGCTGAGATCAGCCACTTCTTCCCCGATAACGGAGACCGGCACACTGGCCATATCGGTGG TCATCATGCGCCAGCTTTCATCCCCGATATGCACCACCGGGTAAAGTTCACGCAAGCAAG CAGCCAAATCAGCCTATCAACCCAAGTCAGCCATGAAATTCGTCGGGGTTATCGCGTCAA GTCTTCTGGTTGTGCCTTCTGCGGTCTCTGGTGACGCTGATAGCTCGAGTTTCGCTCGCT TCTTCGATCAGGATCGTTTCCAGGAGGTTTTCCCGGACGCTGTGGAGCTCTACAACTTCA ACGGTCTTGTGGATGCGGCCAGCAAGTACAGCGAATTCGCTAATACGGGCAACGACGACA ATGACAAGCGTGAGCTGGCAGCGTTCCTGGCTCAAACAGCTCACGAGTGCGACAGCTTCA AGGCCGCGGAAGAGTACGCCCGTGACACCTACTCGGTGTGGCAGTACTGCGACAACGCCA CCTACACGTGTGCCCCCGGTCGCCGTTACCACGGCCGTGGCCCCATTCAGCTCTCATGGA ACTACAATTACTACAATGCTGGCGAAGCTCTGGGCATTGATCTCTTAAACAACCCGGACA TCGTCGCGACAGACACGACGGTGACGTGGATGACTGCGCTTTGGTACTGGATGACTCCGC ATGGCGGCCGTGTGATCCACGACATCGTCGCCGGTGAGAACGGATTCGCTCAATCCACCG ATATCATCAACGGTGGTCTGGAGTGCGGTCCGGACGCTCCCAACACGTCGAACGAGCAAC AACGTATCACGTACTTCACCAAGATGTGCGAGGCTCTGGGCGTGGAGCCTCTGGGCGCCA CCTCGTGCAACGCCTAGAGTGGGTATGCATCAAAACAAGTTTTACAAAGTAGTGAATAAG CAAAAAAGACTTTGCTTGTATTTGTGGCAGCTCCCCTTAAACGCCAGCTTTCATCCCCGA TATGCACCACCGGGTAAAGTTCACGAAGGGCGAGGAGGATAACATGGCCATCATCAAGGA GTTCATGCGCTTCAAGGTGCACATGGAGGGCTCCGTGAACGGCCACGAGTTCGAGATCGA GGGCGAGGGCGAGGGCCGCCCCTACGAGGGCACCCAGACCGCCAAGCTGAAGGTGACCAA GGGTGGCCCCCTGCCCTTCGCCTGGGACATCCTGTCCCCTCAGTTCATGTACGGCTCCAA GGCCTACGTGAAGCACCCCGCCGACATCCCCGACTACTTGAAGCTGTCCTTCCCCGAGGG CTTCAAGTGGGAGCGCGTGATGAACTTCGAGGACGGCGGCGTGGTGACCGTGACCCAGGA CTCCTCCCTGCAGGACGGCGAGTTCATCTACAAGGTGAAGCTGCGCGGCACCAACTTCCC CTCCGACGGCCCCGTAATGCAGAAGAAGACTATGGGCTGGGAGGCCTCCTCCGAGCGGAT GTACCCCGAGGACGGCGCCCTGAAGGGCGAGATCAAGCAGAGGCTGAAGCTGAAGGACGG CGGCCACTACGACGCTGAGGTCAAGACCACCTACAAGGCCAAGAAGCCCGTGCAGCTGCC CGGCGCCTACAACGTCAACATCAAGTTGGACATCACCTCCCACAACGAGGACTACACCAT CGTGGAACAGTACGAACGCGCCGAGGGCCGCCACTCCACCGGCGGCATGGACGAGCTGTA CAAGTAA

Afin d'identifier si cette séquence a une similitude avec des séquences déjà répertoriées, nous allons utiliser l'outil BLAST (Basic Local Alignement Search Tool) sur le site du NCBI (colonne de droite :Popular resources => BLAST => Nucleotide BLAST)
!! Avant de lancer votre BLAST, choisissez l'option 'somewhat similar # MEGABLAST (bas de page du BLASTn)'

• La séquence d'ADNc obtenue est -elle similaire à des séquences référencées dans les banques de données ?
• A partir de quel organisme a donc été réalisé la banque d'ADNc?
• Quel est le numéro d'accession de la séquence protéique codée par la séquence ayant une similarité avec votre ADNc ?

Maintenant que vous avez vérifié la qualité et nature de votre séquence ADNc, il est nécessaire d'identifier le cadre de lecture ouvert (ORF). Pour cela, nous allons prédire les différentes ORF possible sur votre séquence en travaillant sur les différents cadre de lecture.

Pour cela nous allons utiliser l'outil ORFfinder disponible au au NCBI. (colonne de gauche > Resources List > Classement par ordre alpahabétique)

Dans les paramètres d'ORFfinder, indiquer 300nt comme taille minimale des ORFs (=100 acide aminés).

• Interprétez le graphique obtenu
• Quelle ORF vous paraît être la plus probable ? Pourquoi ?
• Comment pouvez-vous le vérifier ?
• Utilisez dans ORF Finder, l'option BLASTp contre la banque de données 'nr (non redundant protein sequences)' et identifiez si l'ORF sélectionnée est la plus probable.

Notez la position de l'ORF (taille, codon start, codon stop, taille attendue de la protéine)

Exercice 2 : Définition d'amorces PCR

Vos analyses précédentes indiquent que votre séquence est correcte, il faut maintenant amplifier la phase ouverte de lecture (ORF) afin de l'insérer dans un vecteur sous contrôle de séquences régulatrices qui permettront son expression après transformation des plantes d'intérêt.

Il faut donc définir des amorces pour faire une PCR.

A partir de votre séquence d'ADNc, faites une recherche d’amorces PCR avec le programme Primer3 disponible ici.

• Quel est le cahier des charges par défaut de la définition d'amorces PCR avec Primer 3 ?
• Obtenez vous un couple d'amorces (primers) PCR dans la zone d'intérêt ?
• Pouvez-vous identifiez un couple de primers avec un Tm=55°C comme optimal (min 52, max 60) dans votre zone d'intéret ?

Vous disposez au laboratoire du couple d'amorces ci-dessous, est-il adapté à votre expérience ?

sens : AATCAGCCTATCAACCCAAG
reverse: TGTTTTGATGCATACCCACT

Exercice 3 : Analyses des plantes exprimant la construction

Trois plantes génétiquement modifiées et possédant la construction précédente ont été obtenues (Trans1, Trans2 et Trans3). Il faut maintenant évaluer si la construction 'chitinase' présente un avantage pour la plante.
Deux expériences ont été réalisés avec avec le champignon phytopathogène Fusarium solani et le champignon opportuniste Candida albicans.

Les résultats des différentes expériences sont présentés

• Quel était l'objectif de l'expérience de la figure 1 ?
• Interprétez la figure 1
• Quel contrôle est manquant dans la Figure 1 ?
• Comment pouvez-vous expliquez les résultats obtenus ?

• Quelle hypothèse a conduit à mener l'expérience de la figure 2 ?
• Interprétez la figure 2

• • Conclure quant à l'intérêt des CHN dans des applications de biotechnologie végétale