TD2 Genome Selection Plantes
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Objectifs
Ce TD a pour but de vous familiariser avec les méthodes de comparaison de séquences biologiques, la recherche de séquences similaires (BLAST), la recherche d'ORF dans une séquence et de mettre en application votre savoir-faire.
Quelques liens utiles:
Contexte
Nous resterons dans le contexte scientifique du précédent TD s'intéressant aux chitinases afin de définir si ces enzymes pourraient avoir un intérêt dans des approches de biotechnologie végétale. On s'intéressera ici à identifier une séquence nucléique de chitinase afin de l'introgresser dans un génome végétal sous contrôle de séquences régulatrices adaptées et d'évaluer si cette approche pourrait permettre de favoriser la protection des plantes lors d'une infection microbienne.
Exercice 1 : Recherche d'ORF sur un ARNm
Le criblage d'une banque d'ADNc de l'oomycète a permis très probablement d'identifier la séquence nucléique correspondant à la protéine 'chitinase GH19' travaillée au cours du précédent TD. L'idée est maintenant de vérifier si cette séquence code effectivement pour la protéine 'chitinase-GH19' afin de pouvoir l'insérer sous contrôle de séquences régulatrices adaptées au sein d'une plante d'intérêt.
La séquence obtenue après criblage de la banque d'ADNc est disponible ci-dessous
>Oom_cDNA
CAAGCAAGCAGCCAAATCAGCCTATCAACCCAAGTCAGCCATGAAATTCGTCGGGGTTATCGCGTCAAGT CTTCTGGTTGTGCCTTCTGCGGTCTCTGGTGACGCTGATAGCTCGAGTTTCGCTCGCTTCTTCGATCAGG ATCGTTTCCAGGAGGTTTTCCCGGACGCTGTGGAGCTCTACAACTTCAACGGTCTTGTGGATGCGGCCAG CAAGTACAGCGAATTCGCTAATACGGGCAACGACGACAATGACAAGCGTGAGCTGGCAGCGTTCCTGGCT CAAACAGCTCACGAGTGCGACAGCTTCAAGGCCGCGGAAGAGTACGCCCGTGACACCTACTCGGTGTGGC AGTACTGCGACAACGCCACCTACACGTGTGCCCCCGGTCGCCGTTACCACGGCCGTGGCCCCATTCAGCT CTCATGGAACTACAATTACTACAATGCTGGCGAAGCTCTGGGCATTGATCTCTTAAACAACCCGGACATC GTCGCGACAGACACGACGGTGACGTGGATGACTGCGCTTTGGTACTGGATGACTCCGCATGGCGGCCGTG TGATCCACGACATCGTCGCCGGTGAGAACGGATTCGCTCAATCCACCGATATCATCAACGGTGGTCTGGA GTGCGGTCCGGACGCTCCCAACACGTCGAACGAGCAACAACGTATCACGTACTTCACCAAGATGTGCGAG GCTCTGGGCGTGGAGCCTCTGGGCGCCACCTCGTGCAACGCCTAGAGTGGGTATGCATCAAAACAAGTTT TACAAAGTAGTGAATAAGCAAAAAAGACTTTGCTTGTATTTGTGGCAGCTCCCCTTAAA
Afin d'identifier si cette séquence a une similitude avec des séquences déjà répertoriée, nous allons utiliser l'outil BLAST (Basic Local Alignement Search Tool) sur le site du NCBI (colonne de droite :Popular resources => BLAST => Nucleotide BLAST)
!! Avant de lancer votre BLAST, choisissez l'option 'somewhat similar # MEGABLAST (bas de page du BLASTn)'
- La séquence d'ADNc obtenue est -elle similaire à des séquences référencées dans les banques de données ?
- A partir de quel organisme a donc été réalisé la banque d'ADNc?
Maintenant que vous avez vérifié la qualité de la séquence nucléique de votre clone, il sera nécessaire de vérifier que l'ADNc code pour la protéine attendue. Pour cela, on déterminera l'ORF la plus probable de l'ADNc en recherchant les cadres de lecture présents.
Nous allons maintenant rechercher sur cette séquence, l'ORF la plus probable. Pour cela nous allons tester 2 outils:
- SixPack sur EMBOSS (rubrique Nucleic translation) en modifiant les paramètres suivants : ORF start with M, minimum size of ORF=100.
Regardez les traductions dans les différents cadres de lecture (les zones en majuscules sont des ORF potentielles (région d’un ATG à un Stop, plus grand que 100 aa). Quelle ORF vous paraît être la plus probable ? Pourquoi ?
- ORF Finder au NCBI. Mettre 300nt comme taille minimale des ORFs. Interprétez le graphique obtenu.
Utilisez dans ORF Finder, l'option Blastp contre SwissProt et identifiez l'ORF la plus probable. Notez la position de l'ORF.
Afin de vérifier le(s) clone(s) obtenu(s) suite au criblage de la banque d'ADNc, un séquençage est réalisé et la séquence obtenue est disponible ici.
- Vérifiez que l'ADNc isolé est celui correspondant à BCL2 par une analyse Blastn sur le site du NCBI (colonne de droite :Popular resources => BLAST => Nucleotide BLAST)
Exercice 1 : Comparaison de 2 séquences avec une matrice de point (dot plot)
- Rechercher les 2 séquences enregistrées sous les numéros d'accession P10415 et Q64373
- Que pouvez vous dire sur ces 2 séquences ?
- Comparer les séquences deux à deux, en utilisant une matrice de point (dotplot).
Les logiciels sont disponibles dans la suite EMBOSS de la Genopole de Toulouse ou du centre de Bioinformatique des Pays Bas
- Utiliser DOTPATH qui permet de dessiner un dotplot avec une taille de mot fixée et visualiser des diagonales 'd'identité'
- Faites la même analyse avec DOTMATCHER en gardant les paramètres par défaut, et qui permet de visualiser des diagnonales de 'similarité'
- Que pouvez-vous conclure ?
Exercice 2: Comparaison de 2 séquences par alignement global et local : Cas d'Ecole
Voici 2 séquences, au format FASTA :
>prot1
MVMEYLVLEKRLKRLREVLEKRQKDLIVFADNVKNEHNFSAIVRTCDAVGVLYLYYYHAE GKKAKINEGITQGSHKWVFIEKVDNPVQKLLEFKNRGFQIVATWLSKESVNFREVDYTKP TVLVVGNELQGVSPEIVEIADKKIVIPMYGMAQSLNVSVATGIILYEAQRQREEKGMYSR PSLSEEEIQKILKKWAYEDVIKERKRTLSTS
>prot2
MVMEYLVLEKRLKRLREVLEKRQKDLIVFADNVKNEHNFSAIVRTCDAVATWLSKESVNF REVDYTKPTVLVVGNELQGVSPEIVEIAVGVLYLYYYHAEGKKAKINEGI
- Faites un dotplot de ces 2 séquences : qu'observez-vous ?
- Faites un alignement global (de bout à bout) entre les 2 séquences avec Stretcher disponible sur EMBOSS
- Qu'observez vous ?
- Combien y a-t-il de gaps ? A quoi correspondent-ils ?
- A quoi correspond le pourcentage de similarité ?
- Quels sont les paramètres de calcul du score ?
- Votre alignement est-il significatif ?
- Faites un alignement local avec Matcher disponible sur EMBOSS.
NB: dans 'alternative matches' indiquez 10, de façon a visualiser 10 alignements locaux
- Qu'observez-vous ?
- Regardez les autres alignements locaux. Sont-il significatifs ?
NB: si vous avez besoin de convertir vos séquences au Format Fasta un petit outil bien utile :ReadSeq
Exercice 3 : Comparaison de plusieurs séquences par alignement multiple
L'idée maintenant est de comparer plusieurs séquences similaires entre elles, afin par exemple d'en définir les liens évolutifs ou d'identifier des 'zones' (motifs/domaines) conservés pouvant décrire la famille protéique
- Dans la banque de données UniProt/SwissProt au NCBI, identifiez les séquences protéiques "THAP" de l'homme, la souris, le poulet et le zebrafish. Eliminez les séquences isoformes 2 et 3.
- Récupérez l'ensemble des séquences dans un fichier au format Fasta
- Réalisez un alignement de l'ensemble des séquences (=alignement multiple) en utilisant Clustal Omega disponible a l'EBI (>Services)
- Trouvez-vous des 'zones similaires' (=domaines) à l'ensemble de ces séquences.
NB : Le motif 'AVPTIF' marque une partie du domaine : le trouvez-vous sur toutes les séquences ?
Nous allons maintenant essayer de construire un pattern/signature caractéristique de cette famille de protéine en sebasant sur les 'zones similaires' préalablement identifiées
- Construire une signature PROSITE à partir de votre alignement (n'utilisez pas le LOGO, sinon vous ne voyez pas précisément les zones de gap)
Voici l'exemple d'un début d'une signature (ou pattern) : Q-L-x(3)-P-x(6)-[FY]-x(2)-V-x(3)-[LVF]-[FGD]-x(2,8)-[GPS]
Comment lire cette signature ?
Q-L : il n'y a que les acides aminés Q puis L dans 2 colonnes successives de l'alignement
x(3) : 3 colonnes avec des acides aminés variables
[FY] : dans cette colonne seuls les acides aminés F ou Y sont présents
x(2,8) : zone avec un gap. Entre 2 et 8 résidus (acides aminés) quelconques, suivant les séquences
- Tester la spécificité de votre signature sur ScanProsite (choisir l'option 2) contre SwissProt ou trEMBL (plus long !)
Mise en application...
Au laboratoire, vous êtes amenés a travailler sur la séquence ci-dessous:
>seq1
attggcaacctgaaagatctgaacattctgtatctgcatagcaacggctttaccggccgc attccgcgcgaaatgagcaacctgaccctggcgaacctgaccgatctggatctgagcggc aaccagctgaccggcaaaattccgcgcgattttgcggcgctgctgctggtgctgctggaa aaaaaaattgaaaacattacctgcgatagcatgaaactgctgagcaaaacctttctgatt ctgaccctgaccttttttttttttggcattgcgctggcgaaacagagctttgaaccggaa attgaagcgctgaaaagctttaaaaacggcattagcaacgatccgctgggcgtgctgagc gattggaccattattggcagcctgcgccattgcaactggaccggcattacctgcgatagc accggccatgtggtgagcgtgagcctgctggaaaaacagctggaaggcgtgctgagcccg gcgattgcgaacctgacctatctgcaggtgctggatctgaccagcaacagctttaccggc aaaattccggcggaaattggcaaactgaccgaactgaaccagctgattctgtatctgaac tattttagcggcagcattccgagcggcatttgggaactgaaaaacattttttatctggat ctgcgcaacaacctgctgagcggcgatgtgccggaagaaatttgcaaaaccagcagcctg gtgctgattggctttgattataacaacctgaccggcaaaattccggaatgcctgggcgat ctggtgcatctgcagatgtttgtggcggcgggcaaccatctgaccggcagcattccggtg agcattggcaccctggcgaacctgaccgatctggatctgagcggcaaccagctgaccggc aaaattccgcgcgattttggcaacctgctgaacctgcagagcctggtgctgaccgaaaac ctgctggaaggcgatattccggcggaaattggcaactgcagcagcctggtgcagctggaa ctgtatgataaccagctgaccggcaaaattccggcggaactgggcaacctggtgcagctg caggcgctgcgcatttataaaaacaaactgaccagcagcattccgagcagcctgtttcgc ctgacccagctgacccatctgggcctgagcgaaaaccatctggtgggcccgattagcgaa gaaattggctttctggaaagcctggaagtgctgaccctgcatagcaacaactttaccggc gaatttccgcagagcattaccaacctgcgcaacctgaccgtgctgaccgtgggctttaac aacattagcggcgaactgccggcggatctgggcctgctgaccaacctgcgcaacctgagc gcgcatgataacctgctgaccggcccgattccgagcagcattagcaactgcaccggcctg aaactgctggatctgagccataaccagatgaccggcgaaattccgcgcggctttggccgc atgaacctgacctttattagcattggccgcaaccattttaccggcgaaattccggatgat atttttaactgcagcaacctggaaaccctgagcgtggcggataacaacctgaccggcacc ctgaaaccgctgattggcaaactgcagaaactgcgcattctgcaggtgagctataacagc ctgaccggcccgattccgcgcgaaattggcaacctgaaagatctgaacattctgtatctg catagcaacggctttaccggccgcattccgcgcgaaatgagcaacctgaccctgctgcag ggcctgcgcatgtatagcaacgatctggaaggcccgattccggaagaaatgtttgatatg aaactgctgagcgtgctggatctgagcaacaacaaatttagcggccagattccggcgctg tttagcaaactggaaagcctgacctatctgagcctgcagggcaacaaatttaacggcagc attccggcgagcctgaaaagcctgagcctgctgaacacctttgatattagcgataacctg ctgaccggcaccattccgggcgaactgctggcgagcctgaaaaacatgcagctgtatctg aactttagcaacaacctgctgaccggcaccattccgaaagaactgggcaaactggaaatg gtgcaggaaattgatctgagcaacaacctgtttagcggcagcattccgcgcagcctgcag gcgtgcaaaaacgtgtttaccctggattttagccagaacaacctgagcggccatattccg gatgaagtgtttcagggcatggatatgattattagcctgaacctgagccgcaacagcttt agcggcgaaattccgcagagctttggcaacatgacccatctggtgagcctggatctgagc agcaacaacctgaccggcgaaattccggaaagcctggcgaacctgagcaccctgaaacat ctgaaactggcgagcaacaacctgaaaggccatgtgccggaaagcggcgtgtttaaaaac attaacgcgagcgatctgatgggcaacaccgatctgtgcggcagcaaaaaaccgctgaaa ccgtgcaccattaaacagaaaagcagccattttagcaaacgcacccgcgtgattctgatt attctgggcagcgcggcggcgctgctgctggtgctgctgctggtgctgattctgacctgc tgcaaaaaaaaagaaaaaaaaattgaaaacagcagcgaaagcagcctgccggatctggat agcgcgctgaaactgaaacgctttgaaccgaaagaactggaacaggcgaccgatagcttt aacagcgcgaacattattggcagcagcagcctgagcaccgtgtataaaggccagctggaa gatggcaccgtgattgcggtgaaagtgctgaacctgaaagaatttagcgcggaaagcgat aaatggttttataccgaagcgaaaaccctgagccagctgaaacatcgcaacctggtgaaa attctgggctttgcgtgggaaagcggcaaaaccaaagcgctggtgctgccgtttatggaa aacggcaacctggaagataccattcatggcagcgcggcgccgattggcagcctgctggaa aaaattgatctgtgcgtgcatattgcgagcggcattgattatctgcatagcggctatggc tttccgattgtgcattgcgatctgaaaccggcgaacattctgctggatagcgatcgcgtg gcgcatgtgagcgattttggcaccgcgcgcattctgggctttcgcgaagatggcagcacc accgcgagcaccagcgcgtttgaaggcaccattggctatctggcgccggaatttgcgtat atgcgcaaagtgaccaccaaagcggatgtgtttagctttggcattattatgatggaactg atgaccaaacagcgcccgaccagcctgaacgatgaagatagccaggatatgaccctgcgc cagctggtggaaaaaagcattggcaacggccgcaaaggcatggtgcgcgtgctggatatg gaactgggcgatagcattgtgagcctgaaacaggaagaagcgattgaagattttctgaaa ctgtgcctgttttgcaccagcagccgcccggaagatcgcccggatatgaacgaaattctg acccatctgatgaaactgcgcggcaaagcgaacagctttcgcgaagatcgcaacgaagat cgcgaagtg
Répondez aux questions suivantes:
- a quel organisme appartient cette séquence ?
- cette séquence est-elle codante ?
- quelle est le numéro d'accession de cette protéine, de l'ARNm, du gène ?
- existe-il des orthologues a cette protéine ?
- que veut dire db_xref=CDD:173623 sur la fiche GenPept?
- quelle est la fonction putative de cette protéine ?
- exite-t-il des domaines conservés dans cette protéine?
