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L2-L3 Bioinfo - TP Traitement d'images

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Contents

TP1 - Traitement d'images

Premier pas dans la segmentation par seuillage

Exercice 1 : objets individualisés

  1. Enregistrez l'image suivante (en notant où vous l'enregistrez) A4-dapi.tif puis ouvrez-la avec ImageJ.
  2. Sachant que 10 microns correspondent à 90 pixels, calibrez votre image en changeant la taille du pixel et l'unité de mesure (micron) dans le menu Analyze->Set Scale. Qu'observez-vous sur les indications de taille de l'image?
  3. Dupliquez l'image avant de commencer la segmentation par seuillage de l’image.
  4. Réalisez un seuillage sur l'image dupliquée de manière à segmenter les noyaux (Image->Adjust->Threshold). Attention, les objets d’intérêts doivent être rouges après exécution de la commande "Apply", vous obtenez une image binarisée.
  5. Avant de lancer une analyse d’objet de votre image binarisée, il est important d’indiquer au logiciel les mesures à réaliser parmi plusieurs choix. Pour cela, choisissez les paramètres à mesurer dans Analyze->Set Measurements :
    • l’aire,
    • le périmètre et
    • l'intensité moyenne.
  6. Réalisez les mesures sur l'image binarisée (Analyze->Analyze Particles). Vous pouvez choisir les tailles min et/ou max des objets à prendre en compte lors de l’analyse et ceci dans le champs Size (cm2), qui par défaut est de min =0 et max = infini. Cochez l'option Add to Manager. Le paramètre Exclude on Egdes est il nécessaire ?
  7. Les mesures géométriques sont-elles satisfaisantes? Et les mesures de l’intensité relative de fluorescence?
  8. Dans la fenêtre ROI Manager, cliquez sur show all afin d’appliquer les masques créés sur l’image d’origine puis cliquez sur Measure. Les mesures de l’intensité relative de fluorescence sont-elles satisfaisantes ?


Notion de MACRO

Exercice 2 : Pour l’instant, c’est simple

Nous allons créer une macro qui permet d’enchaîner les opérations suivantes : Ouverture de l’image A4_Dapi \Rightarrow Segmentation par seuillage de l’image \Rightarrow mesure des surfaces des noyaux \Rightarrow sauvegarde des résultats.

  1. Allez dans Plugins->Macros/Record
  2. Ouvrir l’image A4-dapi.tif. Observez la ligne de code dans la fenêtre Macro record
  3. Allez dans Image->Adjust->Threshold et adaptez le seuillage
  4. Analyze->Set Measurements \Rightarrow choisir l’aire
  5. Analyze->Set Scale
  6. Analyze->Analyze particles
  7. Enregistrez votre macro via la fenêtre Recorder en cliquant sur Create puis File->Save as-> EssaiMacro.txt
  8. Tester votre macro après avoir fermé tous vos fichiers : Plugins->Macros->Run-> EssaiMacro

Exercice 3: Bien réfléchir à sa macro

Créer une macro qui permettra

  1. d’ouvrir l’image A4_DAPI,
  2. de mesurer l’aire, le périmètre et l’intensité moyenne de fluorescence de chaque noyau et
  3. sauver les résultats.

Le fichier résultat ne devra comporter que 3 colonnes et 9 lignes correspondant aux 9 noyaux de l’image et aux 3 mesures c’est-à-dire aire, périmètre et intensité.

PS n°1 : Pour fermer la fenêtre Results :

if (isOpen("Results")) {
       selectWindow("Results");
       run("Close");
}

PS n°2 : Pour sauver automatiquement les résultats :

dir = getDirectory("image"); 
name = getTitle; 
index = lastIndexOf(name, "."); 
if (index!=-1) name = substring(name, 0, index); 
name = name + ".xls"; 
saveAs("Measurements", dir+name); 
print(dir+name);

Traitement semi-automatique d’images de fluorescence de la chlorophylle d’Arabidopsis thaliana

Arabidopsis thaliana ou encore "Arabette des Dames" souvent considérée comme la mauvaise herbe des jardiniers est une plante herbacée de la famille des Brassicacées (crucifère) de 10-15cm de haut à l’état adulte. A. thaliana est formée d'une rosette de feuilles de 2 à 5 cm de diamètre située au ras du sol dont se détachent les racines et un pédoncule floral portant l’inflorescence.

Première plante séquencée en 2000, A. thaliana, dit "Arabette" dans les laboratoires, est une espèce modèle pour les biologistes. En effet Arabette est facile à manipuler en laboratoire car elle est de petite taille et des centaines de pieds et des milliers de graines peuvent être obtenus sur des surfaces de dimensions modestes en quelques mois. De plus, Arabette possède un petit génome, comparé à celui des plantes à fleurs, avec cinq paires de chromosomes et environ 25 000 gènes.

Comme toutes les plantes, Arabette est soumise à différentes contraintes abiotiques (froid, sécheresse) ou biotiques (maladies bactériennes ou fongiques) qui peuvent affecter son développement et donc sa survie. L’idée de l’ensemble de ces TP est de caractériser les acteurs moléculaires qui pourraient faciliter la croissance d’Arabidopsis lorsqu’elle est infectée par une bactérie pathogène en utilisant différents types d’outils allant de l’analyse d’image à la modélisation.

Pour cela, vous utiliserez des données d’un laboratoire de recherche qui a mis en culture dans des pots individuels, 95 sous-espèces (écoytpes) d’Arabette provenant de différents endroits du globe. Une fois le stade adulte atteint, des bactéries pathogènes ont été pulvérisées sur les feuilles. Puis, des acquisitions de la fluorescence chlorophyllienne ont été réalisées 15 jours après la pulvérisation pour chacune des sous-espèces.

Vous aurez chacun 5 images différentes à traiter, correspondant à 5 sous-espèces traitées par des bactéries. Vous devez créer une macro permettant d’avoir la surface foliaire totale pour chacune des images de votre série.

Les images à traiter sont accessibles par série de 5 images. Les liens d'accès aux images se trouvent sur la page liens dont l'intervenant vous fournira les codes d'accès. La calibration des images est de 33 pixels = 1cm.

Les données de la surface foliaire sont à saisir sur le fichier correspondant à votre groupe et dont le lien d'accès est disponible sur la même page que précédemment pour les séries d'images.