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Revision as of 08:39, 14 December 2014

Comparaison de 2 séquences

Vous allez comparer deux autres séquences correspondant à deux facteurs de transcription krox 24 et sp1, contenus dans les fichiers Krox24 et sp1.

En utilisant la suite EMBOSS

1°) Construisez un dotplot avec dotmatcher de ces deux séquences.Vous devez observer une similitude locale.
2°) Comparez ensuite les deux séquences avec un alignement local en utilisant matcher (paramètres par défaut Gap penalty 14 et Gap length penalty. Retrouvez vous le résultat du dotplot?
3°) Consultez les entrées SwissProt (Krox24 accession number P18146 et sp1 accession number P08047)pour déterminer à quoi correspond cette similitude locale.

Le dotplot peut également être utilisé pour étudier les régularités structurelles d'une séquence. Vous allez tester cette approche sur les deux exemples suivants.

• Localisation de répétitions : analysez avec dotpath la séquence de rétrotransposon de tabac contenue dans le fichier Transposon Tnt1 (cochez la case 'Display the overlapping matches'). En jouant sur le paramètre de taille de fénêtre, identifiez le nombre de répétitions significatives ?
• Faible complexité : de la même façon analysez la séquence contenue dans Plasmodium falciparum. Qu'observez-vous? A quoi cela correspond dans la séquence.

Alignement local et alignement global

En utilisant la suite / EMBOSS, nous allons réaliser une comparaison entre les isoformes alpha des proytéines BCL2 humaine et de souris (numéro d'accesion Q64373).

• Faites un dotplot avec dotpath

Concluez

• Faites un alignement global entre les 2 séquences avec Needle

Combien y a-t-il de gaps ?
A quoi correspond le pourcentage de similarité ?
Quels sont les paramètres de calcul du score ?
Modifiez-les et regardez en quoi l'alignement change.

• Faites un alignement local avec Matcher

Qu'observez-vous ?
Demandez à voir d'autres alignements.
Puis modifier les paramètres du score.

Alignement multiple

A partir des résultats obtenus en Blast avec la banque SwissProt, sélectionner un ensemble de séquences pour réaliser l'alignement multiple (une dizaine). Attention, si vous voulez faire ressortir des zones conservées versus des zones peu ou pas conservées au cours de l'évolution, il faut construire un échantillon dans lequel vous prendrez en compte des séquences proches mais aussi des séquences éloignées. Ne pas oublier d'inclure la protéine d'intérêt. Les séquences doivent être extraites au format FASTA. Pour cela, dans la page de réponse de BlastP, cocher les séquences que vous voulez conserver puis à la fin de la page, cliquer sur Get selected sequences. Dans la nouvelle page, choisir dans le menu Display FASTA (text). Sauvegarder les séquences dans un fichier texte.

• Réaliser l'alignement multiple en utilisant le programme ClustalW sur le serveur PBIL. Sauvegarder cet alignement sur votre disque (sur la page de réponse, aller à Result files (text), cliquer sur le lien CLUSTALW, sauvegarder la page).

Analyser l'alignement en repérant notamment les régions conservées.

L'étape suivante consiste à essayer de trouver une explication fonctionnelle et/ou structurale à ces régions conservées. La banque de données PROSITE renferme les signatures protéiques qui ont été établies pour différentes familles de protéines à partir d'alignements multiples dans lesquels les zones conservées ont été repérées. Cette conservation peut être représentée sous forme de motifs consensus ou sous forme de profils matriciels. Ces motifs sont ensuite recherchés dans l'ensemble des séquences, et s'ils ne sont trouvés que dans les séquences appartenant à la famille étudiée, ils sont considérés comme caractéristiques (spécifiques) de cette famille et constituent une signature protéique. Certains motifs peuvent être associés à une fonction (site catalytique, site de liaison à un ion, etc).

• Est-ce que les zones que vous avez repérées correspondent aux motifs et domaines identifiés en tout début d'analyse ?

Recherche de motifs et de domaines dans les séquences

A partir de l'alignement multiple, établir un motif PROSITE correspondant à une zone conservée que vous espérez spécifique de la famille. Exemple d'un motif PROSITE : G-A-[ILV]-X-D. Dans les cas où l'acide aminé est strictement conservé dans toutes les séquences alignées, on fait figurer son code à une lettre. C'est le cas ici des acides aminés G,A et D. Quand à une même position de l'alignement, on observe plusieurs acides aminés, on les énumère entre crochets [ILV]. Si le nombre d'acides aminés différents est trop important, on remplace cette énumération par X qui veut dire n'importe quel acide aminé. Quand on recherchera ce motif dans une séquence, on retiendra comme occurrences GAIMD, GAIRD, GALMD, GAVKD, etc.

• Quand vous avez établi votre motif, rechercher sa présence dans les séquences de SwissProt et TrEMBL (logiciel ScanProsite). D'après les résultats obtenus, pensez-vous qu'il est spécifique aux séquences de la famille à laquelle appartient votre protéine ?

Mise en application

Au laboratoire, vous êtes amenés a travailler sur le gène dont la séquence déduite en acides aminés est présentée ci-dessous:

>prot

MKLLSKTFLILTLTFFFFGIALAKQSFEPEIEALKSFKNGISNDPLGVLSDWTIIGSLRHCNWTGITCDS TGHVVSVSLLEKQLEGVLSPAIANLTYLQVLDLTSNSFTGKIPAEIGKLTELNQLILYLNYFSGSIPSGI WELKNIFYLDLRNNLLSGDVPEEICKTSSLVLIGFDYNNLTGKIPECLGDLVHLQMFVAAGNHLTGSIPV SIGTLANLTDLDLSGNQLTGKIPRDFGNLLNLQSLVLTENLLEGDIPAEIGNCSSLVQLELYDNQLTGKI PAELGNLVQLQALRIYKNKLTSSIPSSLFRLTQLTHLGLSENHLVGPISEEIGFLESLEVLTLHSNNFTG EFPQSITNLRNLTVLTVGFNNISGELPADLGLLTNLRNLSAHDNLLTGPIPSSISNCTGLKLLDLSHNQM TGEIPRGFGRMNLTFISIGRNHFTGEIPDDIFNCSNLETLSVADNNLTGTLKPLIGKLQKLRILQVSYNS LTGPIPREIGNLKDLNILYLHSNGFTGRIPREMSNLTLLQGLRMYSNDLEGPIPEEMFDMKLLSVLDLSN NKFSGQIPALFSKLESLTYLSLQGNKFNGSIPASLKSLSLLNTFDISDNLLTGTIPGELLASLKNMQLYL NFSNNLLTGTIPKELGKLEMVQEIDLSNNLFSGSIPRSLQACKNVFTLDFSQNNLSGHIPDEVFQGMDMI ISLNLSRNSFSGEIPQSFGNMTHLVSLDLSSNNLTGEIPESLANLSTLKHLKLASNNLKGHVPESGVFKN INASDLMGNTDLCGSKKPLKPCTIKQKSSHFSKRTRVILIILGSAAALLLVLLLVLILTCCKKKEKKIEN SSESSLPDLDSALKLKRFEPKELEQATDSFNSANIIGSSSLSTVYKGQLEDGTVIAVKVLNLKEFSAESD KWFYTEAKTLSQLKHRNLVKILGFAWESGKTKALVLPFMENGNLEDTIHGSAAPIGSLLEKIDLCVHIAS GIDYLHSGYGFPIVHCDLKPANILLDSDRVAHVSDFGTARILGFREDGSTTASTSAFEGTIGYLAPEFAY MRKVTTKADVFSFGIIMMELMTKQRPTSLNDEDSQDMTLRQLVEKSIGNGRKGMVRVLDMELGDSIVSLK QEEAIEDFLKLCLFCTSSRPEDRPDMNEILTHLMKLRGKANSFREDRNEDREV

Avec les outils utilisés au cours des différentes séances de TD, répondez aux questions suivantes:

• a quel organisme appartient cette séquence ?
• quelles différences observez-vous lors d'une analyse Blast, sur la nr ou SwissProt ?
• existe-il des orthologues a cette protéine ?
• quelle est le numéro d'accession de cette protéine, de l'ARNm, du gène ?

Sauvegardez la séquence de l'ARNm et du gène au format fasta

• qu'est-ce que TAIR ?
• cette protéine peut-elle interagir avec d'autres protéines ?
• des publications scientifiques sont-elles disponibles sur cette protéine ?
• quelle est la fonction putative de cette protéine ?
• que veut dire db_xref=CDD:173623 sur la fiche GenPept?
• exite-t-il des domaines conservés dans cette protéine? Expliquez votre démarche
• sans tenir compte des informations disponibles dans la fiche GenPep, identifiez le nombre d'introns dans le gène codant cette protéine. Expliquez votre démarche.