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Contents 1 Analyse de la famille protéique 1.1 Recherche dans les banques par similitude de séquences 1.2 Alignement local et alignement global 1.3 Alignement multiple 1.4 Recherche de motifs et de domaines dans les séquences 2 Mise en application

Analyse de la famille protéique

Recherche dans les banques par similitude de séquences

• Utiliser votre protéine (P10415) comme sonde pour une recherche avec le logiciel BlastP sur le site du NCBI, en choisissant soit la banque nr, soit la banque SwissProt.

Différence entre les deux résultats?

Les résultats du programme Blast vous ont montré que votre séquence appartenait à une famille bien représentée dans les banques de données. Vous disposez donc d'un ensemble de séquences qui vont vous permettre de faire une analyse plus approfondie. Dans un premier temps, on va comparer P101415, avec l'orthologue de BCL2 présent chez la souris, et identifié dans votre analyse Blast sur la swissprot. Dans un second temps, nous réaliserons un aligement multiple avec les l'ensemble du jeu de séquences identifié suite a l'analyse Blast notamment pour rechercher la présence de régions conservées dans ces séquences, qui pourront être des sites privilégiés pour des expériences de mutagénèse dirigée.

Alignement local et alignement global

En utilisant la suite EMBOSS, nous allons réaliser une comparaison entre les isoformes alpha des proytéines BCL2 humaine et de souris (numéro d'accesion Q64373).

• Faites un dotplot avec dotpath

Concluez

• Faites un alignement global entre les 2 séquences avec Needle

Combien y a-t-il de gaps ?
A quoi correspond le pourcentage de similarité ?
Quels sont les paramètres de calcul du score ?
Modifiez-les et regardez en quoi l'alignement change.

• Faites un alignement local avec Matcher

Qu'observez-vous ?
Demandez à voir d'autres alignements.
Puis modifier les paramètres du score.

Alignement multiple

A partir des résultats obtenus en Blast avec la banque SwissProt, sélectionner un ensemble de séquences pour réaliser l'alignement multiple (une dizaine). Attention, si vous voulez faire ressortir des zones conservées versus des zones peu ou pas conservées au cours de l'évolution, il faut construire un échantillon dans lequel vous prendrez en compte des séquences proches mais aussi des séquences éloignées. Ne pas oublier d'inclure la protéine d'intérêt. Les séquences doivent être extraites au format FASTA. Pour cela, dans la page de réponse de BlastP, cocher les séquences que vous voulez conserver puis à la fin de la page, cliquer sur Get selected sequences. Dans la nouvelle page, choisir dans le menu Display FASTA (text). Sauvegarder les séquences dans un fichier texte.

• Réaliser l'alignement multiple en utilisant le programme ClustalW sur le serveur PBIL. Sauvegarder cet alignement sur votre disque (sur la page de réponse, aller à Result files (text), cliquer sur le lien CLUSTALW, sauvegarder la page).

Analyser l'alignement en repérant notamment les régions conservées.

L'étape suivante consiste à essayer de trouver une explication fonctionnelle et/ou structurale à ces régions conservées. La banque de données PROSITE renferme les signatures protéiques qui ont été établies pour différentes familles de protéines à partir d'alignements multiples dans lesquels les zones conservées ont été repérées. Cette conservation peut être représentée sous forme de motifs consensus ou sous forme de profils matriciels. Ces motifs sont ensuite recherchés dans l'ensemble des séquences, et s'ils ne sont trouvés que dans les séquences appartenant à la famille étudiée, ils sont considérés comme caractéristiques (spécifiques) de cette famille et constituent une signature protéique. Certains motifs peuvent être associés à une fonction (site catalytique, site de liaison à un ion, etc).

• Est-ce que les zones que vous avez repérées correspondent aux motifs et domaines identifiés en tout début d'analyse ?

Recherche de motifs et de domaines dans les séquences

A partir de l'alignement multiple, établir un motif PROSITE correspondant à une zone conservée que vous espérez spécifique de la famille. Exemple d'un motif PROSITE : G-A-[ILV]-X-D. Dans les cas où l'acide aminé est strictement conservé dans toutes les séquences alignées, on fait figurer son code à une lettre. C'est le cas ici des acides aminés G,A et D. Quand à une même position de l'alignement, on observe plusieurs acides aminés, on les énumère entre crochets [ILV]. Si le nombre d'acides aminés différents est trop important, on remplace cette énumération par X qui veut dire n'importe quel acide aminé. Quand on recherchera ce motif dans une séquence, on retiendra comme occurrences GAIMD, GAIRD, GALMD, GAVKD, etc.

• Quand vous avez établi votre motif, rechercher sa présence dans les séquences de SwissProt et TrEMBL (logiciel ScanProsite). D'après les résultats obtenus, pensez-vous qu'il est spécifique aux séquences de la famille à laquelle appartient votre protéine ?

Mise en application

Au laboratoire, vous êtes amenés a travailler sur le gène dont la séquence déduite en acides aminés est présentée ci-dessous:

>prot

MKLLSKTFLILTLTFFFFGIALAKQSFEPEIEALKSFKNGISNDPLGVLSDWTIIGSLRHCNWTGITCDS TGHVVSVSLLEKQLEGVLSPAIANLTYLQVLDLTSNSFTGKIPAEIGKLTELNQLILYLNYFSGSIPSGI WELKNIFYLDLRNNLLSGDVPEEICKTSSLVLIGFDYNNLTGKIPECLGDLVHLQMFVAAGNHLTGSIPV SIGTLANLTDLDLSGNQLTGKIPRDFGNLLNLQSLVLTENLLEGDIPAEIGNCSSLVQLELYDNQLTGKI PAELGNLVQLQALRIYKNKLTSSIPSSLFRLTQLTHLGLSENHLVGPISEEIGFLESLEVLTLHSNNFTG EFPQSITNLRNLTVLTVGFNNISGELPADLGLLTNLRNLSAHDNLLTGPIPSSISNCTGLKLLDLSHNQM TGEIPRGFGRMNLTFISIGRNHFTGEIPDDIFNCSNLETLSVADNNLTGTLKPLIGKLQKLRILQVSYNS LTGPIPREIGNLKDLNILYLHSNGFTGRIPREMSNLTLLQGLRMYSNDLEGPIPEEMFDMKLLSVLDLSN NKFSGQIPALFSKLESLTYLSLQGNKFNGSIPASLKSLSLLNTFDISDNLLTGTIPGELLASLKNMQLYL NFSNNLLTGTIPKELGKLEMVQEIDLSNNLFSGSIPRSLQACKNVFTLDFSQNNLSGHIPDEVFQGMDMI ISLNLSRNSFSGEIPQSFGNMTHLVSLDLSSNNLTGEIPESLANLSTLKHLKLASNNLKGHVPESGVFKN INASDLMGNTDLCGSKKPLKPCTIKQKSSHFSKRTRVILIILGSAAALLLVLLLVLILTCCKKKEKKIEN SSESSLPDLDSALKLKRFEPKELEQATDSFNSANIIGSSSLSTVYKGQLEDGTVIAVKVLNLKEFSAESD KWFYTEAKTLSQLKHRNLVKILGFAWESGKTKALVLPFMENGNLEDTIHGSAAPIGSLLEKIDLCVHIAS GIDYLHSGYGFPIVHCDLKPANILLDSDRVAHVSDFGTARILGFREDGSTTASTSAFEGTIGYLAPEFAY MRKVTTKADVFSFGIIMMELMTKQRPTSLNDEDSQDMTLRQLVEKSIGNGRKGMVRVLDMELGDSIVSLK QEEAIEDFLKLCLFCTSSRPEDRPDMNEILTHLMKLRGKANSFREDRNEDREV

Avec les outils utilisés au cours des différentes séances de TD, répondez aux questions suivantes:

• a quel organisme appartient cette séquence ?
• quelles différences observez-vous lors d'une analyse Blast, sur la nr ou SwissProt ?
• existe-il des orthologues a cette protéine ?
• quelle est le numéro d'accession de cette protéine, de l'ARNm, du gène ?

Sauvegardez la séquence de l'ARNm et du gène au format fasta

• qu'est-ce que TAIR ?
• cette protéine peut-elle interagir avec d'autres protéines ?
• des publications scientifiques sont-elles disponibles sur cette protéine ?
• quelle est la fonction putative de cette protéine ?
• que veut dire db_xref=CDD:173623 sur la fiche GenPept?
• exite-t-il des domaines conservés dans cette protéine? Expliquez votre démarche
• sans tenir compte des informations disponibles dans la fiche GenPep, identifiez le nombre d'introns dans le gène codant cette protéine.