M2R ADAM

From silico.biotoul.fr

Revision as of 10:11, 14 September 2018

Introduction

Le but de ce TD est de se familiariser avec les concepts et les outils de biologie moléculaire nécessaires à l’analyse de séquences nucléiques (clonage, analyse de restriction, alignement...) par utilisation de logiciel dédié.

La version gratuite académique de BenchLing sera utilisé pour ce TD. D'autres logiciels comme Serial Cloner , CLC, / pDRAW32 sont également disponibles pour réaliser ce type d'analyse.

Contexte Scientifique du TD

Une étude biochimique a permis d’isoler une protéine pariétale de l’oomycète Phytophthora parasitica, parasite racinaire de nombreuses solanacées. Cette protéine, nommée CBEL (Celluose-Binding Elicitor Lectin), est reconnue par la plante (=effecteur), entraînant une mort localisée de certaines cellules végétales. Pour poursuivre les études une protéine recombinante doit etre produite. On se propose ici de cloner l'ADNc de CBEL dans le vecteur d’expression pVX (virus X de la pomme de terre) pour obtenir le vecteur pVX-CBEL.

Différentes étapes seront réalisées pour mener à bien ce projet.

   Etape 1 : choix des enzymes de restriction adaptées pour le clonage dans le vecteur pVX
   Etape 2 : création d'une carte du plasmide pVX-CBEL
   Etape 3 : identification in silico des clones recombinants positifs
   Etape 4 : définition d'amorce
   Etape 5 : séquençage
   Etape 6 : analyse des résultats

Installation de BenchLing et prise en main de l'outil

• Connectez vous à BenchLing, et créez vous un compte sur la version 'Académique' (For Academia > Sign In).
• Regardez les principales fonctions du logiciel en travaillant avec la carte du plasmide pBR322
• Créez-vous un projet 'TDM2' ou vous sauvegarderez toutes vos données de ce TD

 Création de projet 
   Dans benchling, en haut a gauche, cliquez sur le logo 'valise'
   Puis sur le signe +, et identifiez votre projet sous le nom 'TDM2'
   Notez que votre projet peut-être partagé avec des collaborateurs

Etape 1: choix des enzymes de restriction adaptées pour le clonage dans le vecteur pVX

- L'ADNc pleine taille de CBEL est présent dans un vecteur nommé pBlueScript_SK (pBSK, 3 736pb), présentant un gène codant une résistance à l’ampicilline.

- Le carte du vecteur pVX d'expression, et son site multiple de clonage (MCS), ainsi que la séquence partielle (MCS + insert CBEL) du plasmide pBSK_CBEL sont disponibles ici.

Q1

• Décrire les principales étapes du clonage à réaliser.
• Indiquez comment vous sélectionnez les clones recombinants.

- Afin d’identifier les sites de restriction compatible entre le vecteur d'entrée pBSK_CBEL comportant l'insert CBEL et le vecteur de destination pVX, nous allons visualiser les différentes cartes de restriction via BenchLing.

   Créer la carte du vecteur de destination pVX dans BenchLing 
   Placez vous dans votre projet 'TDM2' (cliquez sur le logo 'valise', colonne de gauche)
   Cliquez sur le signe + (colonne de gauche)> DNA sequence > New DNA Sequence > Entrez le nom de votre fragment d'ADN (i,e pVX_MCS) 
   > Circular > Copier coller votre séquence (partie gauche de la zone de travail)

Enregistrez sur votre ordi puis ouvrir dans pDRAW le fichier test nommé pATS_CBEL.PDW. NB : les fichiers lisibles dans pDRAW présentent l'extension .PDW

   Tester les différents fonctions de pDRAW (DNA linear, circular, restriction enzyme...)

Q2

• Via pDRAW, identifiez les sites de restriction compatibles entre le vecteur pBSK_CBEL et du MCS de PVX.
• Sauvegarder pour la suite du TD, la carte du MCS_insert CBEL de pBSK (fichier : MCS_pBSK_CBEL.pdw).
• En cas de nécessité vous pouvez télécharger le fichier de correction MCS_pBSK_CBEL.