M2R ADAM

From silico.biotoul.fr

Revision as of 13:10, 14 September 2018

Introduction

Le but de ce TD est de se familiariser avec les concepts et les outils de biologie moléculaire nécessaires à l’analyse de séquences nucléiques (clonage, analyse de restriction, alignement...) par utilisation de logiciel dédié.

La version gratuite académique de BenchLing sera utilisé pour ce TD. D'autres logiciels comme Serial Cloner , CLC, / pDRAW32 sont également disponibles pour réaliser ce type d'analyse.

Contexte Scientifique du TD

Une étude biochimique a permis d’isoler une protéine pariétale de l’oomycète Phytophthora parasitica, parasite racinaire de nombreuses solanacées. Cette protéine, nommée CBEL (Celluose-Binding Elicitor Lectin), est reconnue par la plante (=effecteur), entraînant une mort localisée de certaines cellules végétales. Pour poursuivre les études une protéine recombinante doit etre produite. On se propose ici de cloner l'ADNc de CBEL dans le vecteur d’expression pVX (virus X de la pomme de terre) pour obtenir le vecteur pVX-CBEL.

Différentes étapes seront réalisées pour mener à bien ce projet.

   Etape 1 : choix des enzymes de restriction adaptées pour le clonage dans le vecteur pVX
   Etape 2 : création d'une carte du plasmide pVX-CBEL
   Etape 3 : identification in silico des clones recombinants positifs
   Etape 4 : définition d'amorce
   Etape 5 : séquençage
   Etape 6 : analyse des résultats

Installation de BenchLing et prise en main de l'outil

• Connectez vous à BenchLing, et créez vous un compte sur la version 'Académique' (For Academia > Sign In).
• Regardez les principales fonctions du logiciel en travaillant avec la carte du plasmide pBR322
• Créez-vous un projet 'TDM2' ou vous sauvegarderez toutes vos données de ce TD

 Création de projet 
   Dans benchling, en haut a gauche, cliquez sur le logo 'valise'
   Puis sur le signe +, et identifiez votre projet sous le nom 'TDM2'
   Notez que votre projet peut-être partagé avec des collaborateurs

Etape 1: choix des enzymes de restriction adaptées pour le clonage dans le vecteur pVX

- L'ADNc pleine taille de CBEL est présent dans un vecteur nommé pBlueScript_SK (pBSK, 3 736pb), présentant un gène codant une résistance à l’ampicilline.

- Le carte du vecteur pVX d'expression, et son site multiple de clonage (MCS), ainsi que la séquence partielle (MCS + insert CBEL) du plasmide pBSK_CBEL sont disponibles ici.

Q1

• Décrire les principales étapes du clonage à réaliser.
• Indiquez comment vous sélectionnez les clones recombinants.

- Afin d’identifier les sites de restriction compatible entre le vecteur d'entrée pBSK_CBEL comportant l'insert CBEL et le vecteur de destination pVX, nous allons visualiser les différentes cartes de restriction via BenchLing.

   Créer la carte du vecteur de destination pVX dans BenchLing 
   Placez vous dans votre projet 'TDM2' (cliquez sur le logo 'valise', colonne de gauche)
   Cliquez sur le signe + (colonne de gauche)> DNA sequence > New DNA Sequence > Entrez le nom de votre fragment d'ADN (i,e pVX_MCS) 
   > Circular > Copier coller votre séquence (partie gauche de la zone de travail)

   Identifiez les sites de restriction à coupure unique sur le MCS du pVX
   Cliquez sur le logo 'ciseau' (colonne de droite)
   Identifiez les enzymes présentant un site de coupure unique, et disponible chez le fournisseur Proméga

- Réalisez la même démarche avec la zone du MCS du vecteur pBSK présentant l'insert CBEL (ie pBSK_MCS_CBEL)

Q2

• quels sont les sites de restrcition utilisables avec des enzymes de restriction de Proméga, utilisables pour le clonage de l'insert CBEL dans le vecteur pVX ?

Etape 2: création d'une carte du plasmide pVX-CBEL

L'identification des clones recombinants contenant l'insert CBEL peut s'effectuer à la paillasse par une digestion enzymatique des clones candidats pVX_CBEL ou encore par PCR.

Pour prédire la taille des inserts libérés par analyse de restriction, une digestion in silico du vecteur recombinant pVX_CBEL peut-réalisée. Il faut donc créer la carte du nouveau plasmide.

   Utilisation de BenchLing pour créer des cartes de plasmide
   Obtenez la carte du plasmide pVX dont la séquence et les caractéristiques sont disponibles sur ce lien:  pVX sequence
   Vous pouvez ouvrir ce fichier directement dans BenchLing en cliquant sur + > DNA Sequence > Import DNA Sequence
   Vous pouvez demander une annotation automatique du vecteur dans colonne de droite le logo 'enveloppe'
   Vous pouvez aussi ajouter manuellement certaines annotation. 
   Indiquez par exemple la cassette ampicilline (AMPI) sur votre vecteur en position [31-846] du brin complémentaire

Il faut maintenant réaliser le clonage in silico de l'insert CBEL contenu dans le MCS du pBSK dans le vecteur de destination pVX pour en générer la carte

  Utilisation de BenchLing pour créer des cartes de plasmide apres clonage in silico
  En étant sur la carte du vecteur pVX, cliquez sur Assembly Wizzard (en bas a droite) > Create New Assembly >Digest and Ligate > Start
  En bas de votre écran, une fenêtre SET FRAGMENT, BACKBONE et INSERT se sont ouvertes: c'est ici qu'il faut indiquer les fragments a cloner
  Sélectionner la zone d'intérêt du vecteur pVX (ie à l'extérieur des 2 sites de restriction, clic droit) (fragment)
  Faites la même chose avec l'insert CBEL dans le fichier pBSK_MCS_CBEL (insert)
  Si tout est bon, un logo vert apparait en bas a droite: cliquez dessus puis Assemble
  Enregistrez votre travail dans le projet TDM2
  Renommez le plasmide obtenu en 'pVX_CBEL' pour cela cliquez sur le logo 'horloge' (colonne de droite)
  

• En cas de nécessité vous pouvez télécharger le fichier de correction pVX_CBEL.

Etape 3: identification in silico des clones recombinants positifs

Le clonage et la transformation d’E. coli ont été réalisés avec le vecteur pVX_CBEL. Les colonies bactériennes ont été étalées sur milieu sélectif. L’ADN plasmidique de 3 clones recombinants positifs putatifs a été extrait et digéré via les 2 enzymes de restriction utilisées pour le clonage. Afin de définir le profil de restriction d'un clone recombinant positif, une digestion in silico du vecteur pVX_CBEL peut-être réalisée.

   Réaliser une digestion in silico (profil de restriction)
   Sur le fichier pVX_CBEL, réalisez une digestion avec les 2 enzymes d'intérêt. 
   Pour cela cliquer sur le logo ciseau (a droite) > sélectionnez vos enzymes > Run Digest
   Visualiser le gel d'électrophorèse en cliquant sur l'onglet 'virtuel digest' (juste en dessous du nom du fichier)
   Indiquez les tailles des fragemnts obtenus après double digestion

Ci-dessous le profil de restriction des 3 clones, est présenté :

Q3

• Comment peut-on interpréter ces résultats ?

Q4

• Que faut-il faire pour la suite des expériences ?

Etape 4: définition d'amorces

Pour valider les clones positifs, une vérification par séquençage de la zone d'intérêt est nécessaire. Il faut donc disposer d'amorces (oligonuclétoides) adéquats pour le séquençage. Différents logiciels sont disponibles pour définir des amorces dont PrimerBlastqui présente l'avantage de combiner un logiciel de définition de primer disponible sur le Web (Primer 3), à une analyse de type Blast de vos primers sur les banques du NCBI pour en vérifier leurs spécificités. Vous pouvez aussi définir des oligonucléotides sur Benchling

  Utilisation de BenchLing pour l'obtention d'oligonucléotides
   Copier-coller la séquence du vecteur pVX_CBEL au format fasta, dans le grand cadre blanc en haut de page
   Définir dans "range" les positions de la zone à amplifier
   Définir la taille de l'insert à amplifier (sans importance pour le séquençage, indispensable pour une PCR ou qPCR)
   Définir le Tm de vos primers (paramètres par défaut)
   Sélectionnez les banques à utiliser pour l'analyse Blast (Organism : all, database : nr)

   Utilisation de Primer-Blast pour l'obtention d'oligonucléotides
   Copier-coller la séquence du vecteur pVX_CBEL au format fasta, dans le grand cadre blanc en haut de page
   Définir dans "range" les positions de la zone à amplifier
   Définir la taille de l'insert à amplifier (sans importance pour le séquençage, indispensable pour une PCR ou qPCR)
   Définir le Tm de vos primers (paramètres par défaut)
   Sélectionnez les banques à utiliser pour l'analyse Blast (Organism : all, database : nr)

   Modification du format de séquences (fasta, texte..)
   Utilisez le logiciel SeqRet
   Copier-coller la séquence pVX_CBEL générée avec pDRAW32 dans le cadre
   Choisir le format de sortie "pearson/fasta"
   Sauvegarder votre séquence pVX_CBEL, format fasta, pour l'utilisation dans Primer_Blast

Q5

• Définir un couple d'amorce permettant le séquençage de la zone d'intérêt en 5' et 3' (jonction vecteur/insert ; insert CBEL ; jonction insert / vecteur) de pVX_CBEL